Пст я
Pst I типа II представляет собой эндонуклеазу рестрикции , выделенную из грамотрицательных видов Providencia stuartii .
Функция
[ редактировать ]Pst I расщепляет ДНК по последовательности узнавания 5'-CTGCA/G-3', образуя фрагменты с 3'-когезионными концами. [1] В результате этого расщепления образуются липкие концы длиной в 4 пары оснований. PstI каталитически активен в виде димера. Две субъединицы связаны осью симметрии 2-го порядка, которая в комплексе с субстратом совпадает с осью диады последовательности узнавания . Он имеет молекулярную массу 69 500 и содержит 54 положительных и 41 отрицательно заряженный остаток. [2]
| Последовательность распознавания | Вырезать сайт |
|---|---|
5'CTGCAG 3' 3'GACGTC 5' | 5'--CTGCA G--3' 3'--G ACGTC—5' |
Система рестрикции/модификации PstI (R/M) состоит из двух компонентов: фермента рестрикции, который расщепляет чужеродную ДНК, и метилтрансферазы , которая защищает нативные цепи ДНК путем метилирования аденинового основания внутри последовательности узнавания. Сочетание обоих обеспечивает механизм защиты от вторжения вирусов. [3] Метилтрансфераза и эндонуклеаза кодируются как два отдельных белка и действуют независимо. В системе PstI гены кодируются на противоположных цепях и, следовательно, должны транскрибироваться с разных промоторов . Сайты инициации транскрипции разделены всего 70 парами оснований . [4] Задержка экспрессии эндонуклеазы по сравнению с метилазой обусловлена внутренними различиями этих двух белков. [5] Эндонуклеаза представляет собой димер, для сборки которого требуется второй этап, тогда как метилаза представляет собой мономер.
PstI функционально эквивалентен BsuBI. Оба фермента распознают целевую последовательность 5'CTGCAG. Ферментные системы имеют сходные метилтрансферазы (идентичность аминокислот 41%), эндонуклеазы рестрикции (идентичность аминокислот 46%) и генетический состав (идентичность нуклеотидов 58%). [6] Эти наблюдения предполагают общую эволюционную историю.
При изучении преимущественного двухцепочечного расщепления ДНК эндонуклеаза рестрикции PstI связывается с плазмидной ДНК pSM1. [7]
клонирование ДНК
[ редактировать ]PstI — полезный фермент для клонирования ДНК, поскольку он обеспечивает селективную систему для создания гибридных молекул ДНК. [8] Эти гибридные молекулы ДНК затем можно расщепить по регенерированным сайтам PstI. Его использование не ограничивается молекулярным клонированием; он также используется при картировании сайтов рестрикции, генотипировании, Саузерн-блоттинге, полиморфизме длины рестрикционных фрагментов (RFLP) и SNP. [9] Это также изошизомерный фермент рестрикции SalPI из Streptomyces albus P. [10]
Расщепление
[ редактировать ]PstI преимущественно расщепляет очищенную ДНК pSM1, не подвергаясь влиянию сверхспиральности субстрата. [11] Однако неизвестно, возникают ли эффекты этого расщепления при связывании с сайтом узнавания или при расщеплении ДНК. Его различная скорость расщепления в разных сайтах рестрикции обусловлена пятью особенностями дуплексной структуры. Близость концов линейной молекулы ДНК, изменчивость последовательности ДНК в сайтах узнавания ферментов, короткое расстояние между областями необычных последовательностей ДНК и сайтами узнавания и, наконец, особые структуры, такие как петли и шпильки. Коллективный эффект этих пяти факторов может повлиять на доступность фермента рестрикции к сайтам его узнавания.
Связь
[ редактировать ]![[икона]](http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/1/1c/Wiki_letter_w_cropped.svg/20px-Wiki_letter_w_cropped.svg.png){kind=small} | Этот раздел пуст. Вы можете помочь, добавив к нему . ( май 2016 г. ) |
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Псти (10 ед/л) – Термо Фишер Сайентифик» . www.thermofisher.com . Проверено 29 апреля 2016 г.
- ^ Уолдер, РЮ; Уолдер, Дж.А.; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI» . Журнал биологической химии . 259 (12): 8015–8026. дои : 10.1016/S0021-9258(17)42896-1 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 6330092 .
- ^ Уолдер, РЮ; Хартли, Дж.Л.; Донельсон, Дж. Э.; Уолдер, Дж. А. (1 марта 1981 г.). «Клонирование и экспрессия системы рестрикции-модификации Pst I в Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 78 (3): 1503–1507. Бибкод : 1981PNAS...78.1503W . дои : 10.1073/pnas.78.3.1503 . ISSN 0027-8424 . ПМК 319159 . ПМИД 6262807 .
- ^ Уолдер, РЮ; Уолдер, Дж.А.; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI» . Журнал биологической химии . 259 (12): 8015–8026. дои : 10.1016/S0021-9258(17)42896-1 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 6330092 .
- ^ Уолдер, РЮ; Уолдер, Дж.А.; Донельсон, Дж. Э. (25 июня 1984 г.). «Организация и полная нуклеотидная последовательность системы рестрикции-модификации PstI» . Журнал биологической химии . 259 (12): 8015–8026. дои : 10.1016/S0021-9258(17)42896-1 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 6330092 .
- ^ Сюй, ГЛ; Капфер, В; Уолтер, Дж; Траутнер, Т.А. (25 декабря 1992 г.). «BsuBI - изоспецифическая система ограничения и модификации PstI: характеристика генов и ферментов BsuBI» . Исследования нуклеиновых кислот . 20 (24): 6517–6523. дои : 10.1093/нар/20.24.6517 . ISSN 0305-1048 . ПМК 334566 . ПМИД 1480472 .
- ^ Армстронг, Карен (1982). «Преимущественное сайт-зависимое расщепление эндонуклеазой рестрикции PstI» . Исследования нуклеиновых кислот . 10 (3): 993–1007. дои : 10.1093/нар/10.3.993 . ПМК 326216 . ПМИД 6278444 .
- ^ Боливар, Ф; Родригес, РЛ; Грин, ПиДжей; Бетлах, MC; Хейнекер, Х.Л.; Бойер, Х.В.; Кроза, Дж. Х.; Фальков, С (1977). «Создание и характеристика новых средств клонирования. II. Многоцелевая система клонирования». Джин . 2 (2): 95–113. дои : 10.1016/0378-1119(77)90000-2 . ПМИД 344137 .
- ^ «ПстИ» .
- ^ Картер, Жаклин (1980). «Сравнение расщепления ДНК ферментами рестрикции SalPI и PstI» . Исследования нуклеиновых кислот . 8 (21): 4943–54. дои : 10.1093/нар/8.21.4943 . ПМК 324271 . ПМИД 6255438 .
- ^ Томас, М. (1975). «Исследование расщепления ДНК бактериофага лямбда эндонуклеазой рестрикции EcoRI». Журнал молекулярной биологии . 91 (3): 315–328. дои : 10.1016/0022-2836(75)90383-6 . ПМИД 1102702 .