Условный нокаут гена
Условный нокаут гена — это метод, используемый для устранения определенного гена в определенной ткани, например, в печени. [ 1 ] [ 2 ] Этот метод полезен для изучения роли отдельных генов в живых организмах. Он отличается от традиционного нокаута генов, поскольку нацелен на определенные гены в определенное время, а не удаляется с самого начала жизни. Использование метода условного нокаута генов устраняет многие побочные эффекты традиционного нокаута генов . При традиционном нокауте гена может произойти эмбриональная смерть гена из-за мутации , и это не позволяет ученым изучать ген у взрослых. Некоторые ткани невозможно должным образом изучить изолированно, поэтому ген должен быть неактивен в одной ткани, оставаясь активным в других. С помощью этой технологии ученые могут нокаутировать гены на определенной стадии развития и изучать, как нокаут гена в одной ткани влияет на тот же ген в других тканях. [ 3 ] [ 4 ]
Техника
[ редактировать ]
Наиболее часто используемым методом является система рекомбинации Cre-lox. Фермент Cre-рекомбиназа специфически распознает два сайта lox (локуса рекомбинации) внутри ДНК и вызывает рекомбинацию между ними. Во время рекомбинации две цепи ДНК обмениваются информацией. Эта рекомбинация вызовет делецию или инверсию генов между двумя сайтами lox, в зависимости от их ориентации. Весь ген можно удалить, чтобы инактивировать его. [ 1 ] [ 3 ] Вся эта система индуцируема, поэтому можно добавить химическое вещество, чтобы выбить гены в определенное время. Двумя наиболее часто используемыми химическими веществами являются тетрациклин, который активирует транскрипцию гена рекомбиназы Cre, и тамоксифен, который активирует транспорт белка рекомбиназы Cre в ядро. [ 4 ] Лишь несколько типов клеток экспрессируют рекомбиназу Cre, и ни одна клетка млекопитающих не экспрессирует ее, поэтому нет риска случайной активации lox-сайтов при использовании условного нокаута гена у млекопитающих. Выяснение того, как экспрессировать Cre-рекомбиназу в организме, обычно является самой сложной частью этого метода. [ 3 ]
Использование
[ редактировать ]Метод условного нокаута гена часто используется для моделирования заболеваний человека у других млекопитающих. [ 2 ] Это расширило возможности ученых изучать такие заболевания, как рак, которые развиваются в определенных типах клеток или на стадиях развития. [ 4 ] Известно, что мутации гена BRCA1 связаны с раком молочной железы. BRCA1 Ученые использовали условный нокаут гена, чтобы удалить аллель в ткани молочной железы мышей, и обнаружили, что он играет важную роль в подавлении опухоли. [ 3 ]
специфический ген, В мозгу мышей который, как полагают, участвует в возникновении болезни Альцгеймера и который кодирует фермент циклин-зависимую киназу 5 был нокаут (Cdk5). Было обнаружено, что такие мыши «умнее» обычных мышей и способны более разумно справляться со сложными задачами по сравнению с «нормальными» мышами, выведенными в лаборатории. [ 5 ]
Проект Knockout Mouse (KOMP)
[ редактировать ]Условные нокауты генов у мышей часто используются для изучения заболеваний человека, поскольку многие гены вызывают сходные фенотипы у обоих видов. В течение последних 100 лет для этого использовалась генетика лабораторных мышей, поскольку мыши — это млекопитающие, физиологически достаточно похожие на человека, чтобы проводить качественные исследования. У этих двоих настолько схожие гены, что из 4000 изученных генов только 10 были обнаружены у одного вида, но не у другого. Примерно 80 миллионов лет назад все млекопитающие имели одного и того же общего предка; технически говоря, все геномы млекопитающих сравнительно схожи. Однако по сравнению с мышами и людьми их белково-кодирующие области геномов идентичны на 85% и имеют сходство между 99% их гомологов. Эти сходства приводят к тому, что между двумя видами проявляются схожие фенотипы.[8][12] Их гены очень похожи на человеческие: 99% имеют схожие гомологи. Наряду с созданием подобных фенотипов, они также делают их очень многообещающими кандидатами на условный нокаут генов.[8] Цель KOMP — создать нокаутные мутации в эмбриональных стволовых клетках для каждого из 20 000 генов, кодирующих белок у мышей. [ 2 ] Гены выведены из строя, потому что это лучший способ изучить их функции и узнать больше об их роли в заболеваниях человека. Существует две основные стратегии условного нокаута генов: нацеливание на гены или гомологичная рекомбинация и захват генов. Оба метода обычно используют модифицированный вирусный вектор или линейный фрагмент в качестве способа транспортировки искусственной ДНК в целевую ES-клетку. Затем клетки растут в чашке Петри в течение нескольких дней и вводятся в эмбрионы на ранних стадиях. Наконец, эмбрионы помещаются в матку взрослой самки, где они могут вырасти в потомство.[9] Некоторые аллели в этом проекте невозможно выбить традиционными методами и требуют специфичности метода условного нокаута генов. Чтобы нокаутировать последние оставшиеся аллели, необходимы другие комбинаторные методы. Условный нокаут гена — трудоемкая процедура, и существуют дополнительные проекты, направленные на нокаут оставшихся мышиных генов. [ 6 ] Участник проекта KOMP, Оливер Смитис , возможно, оказал самое большое научное влияние на это нацеливание на гены. Оливер получил Нобелевскую премию по медицине за технологию, позволяющую определять функции генов и за использование метода «нокаута» для удаления определенных генов. К сожалению, пионер генного таргетинга умер в возрасте 91 года 10 января 2017 года.[11] Проект KOMP был начат в 2006 году и продолжается до сих пор. [ 7 ] Репозиторий KOMP стимулирует участников проектов возвращать им отзывы, а тем, кто соответствует определенным критериям, может быть возмещено 50% стоимости их исследовательских ячеек.[10]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Варшней, Гуарав; Берджесс, Шон (26 октября 2013 г.). «Ресурсы мутагенеза и фенотипирования рыбок данио для изучения развития и болезней человека» . Брифинги по функциональной геномике . 13 (2): 82–94. дои : 10.1093/bfgp/elt042 . ПМЦ 3954039 . ПМИД 24162064 .
- ^ Jump up to: а б с Скарнес, Уильям; Розен, Барри; и др. (2011). «Ресурс с условным нокаутом для полногеномного исследования функции генов мыши» . Природа . 474 (7351): 337–342. дои : 10.1038/nature10163 . ПМК 3572410 . ПМИД 21677750 .
- ^ Jump up to: а б с д Кларк, Алан (21 марта 2000 г.). «Манипулирование зародышевой линией: его влияние на изучение канцерогенеза» . Канцерогенез . 21 (3): 435–441. дои : 10.1093/carcin/21.3.435 . ПМИД 10688863 .
- ^ Jump up to: а б с Чжан, Цзянь; Чжао, Цзин (июль 2012 г.). «Условные манипуляции с генами: создание новой биологической эры» . J Чжэцзянский университет, бакалавр наук . 13 (7): 511–524. дои : 10.1631/jzus.b1200042 . ПМК 3390709 . ПМИД 22761243 .
- ^ «Повышение интеллекта посредством генной инженерии» . 29 мая 2007 г. Проверено 30 мая 2015 г.
- ^ Гуань, Чунмей; Йе, Чао; Ян, Сяомэй; Гао, Цзянган (2010). «Обзор текущих крупномасштабных усилий по нокауту мышей». Бытие . 48 (2): 73–85. дои : 10.1002/dvg.20594 . ПМИД 20095055 . S2CID 34470273 .
- ^ Гондо, Ю (2008). «Тенденции крупномасштабного мутагенеза мышей: от генетики к функциональной геномике» . Нат. Преподобный Жене . 9 (10): 803–810. дои : 10.1038/nrg2431 . ПМИД 18781157 . S2CID 1435836 . Проверено 5 ноября 2015 г.
8. Остин, К.П., Бэтти, Дж.Ф., Брэдли, А., Бьюкан, М., Капечки, М., Коллинз, Ф.С., Дав, В.Ф., Дуйк, Г., Даймеки, С., Эппиг, Дж.Т., Гридер, Ф.Б. , Хайнц, Н., Хикс, Г., Инсел, Т.Р., Джойнер, А., Коллер, Б.Х., Ллойд, К.С., Магнусон, Т., Мур, М.В., Надь, А., ... Замбровиц, Б. ( 2004). Проект нокаутирующей мыши. Генетика природы, 36 (9), 921–924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921
9. Информационный бюллетень о нокаутирующих мышах. (н-й). Получено с https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet.
10. Ллойд К.С. (2011). Отличный ресурс о мышах для биомедицинского исследовательского сообщества. Анналы Нью-Йоркской академии наук, 1245, 24–26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x
11. Лауреат Нобелевской премии доктор Оливер Смитис выступит с лекцией для пожертвований Эрла Х. Морриса 10 июля (nd). Получено с https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture.
12. НИЗ. (н-й). Почему мышь имеет значение. Получено с https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome.