Циклическая сборка полимеразы

Полимеразная циклическая сборка (или PCA , также известная как сборочная ПЦР ) — это метод сборки больших ДНК олигонуклеотидов из более коротких фрагментов. В этом процессе используется та же технология, что и в ПЦР , но используются преимущества гибридизации и отжига ДНК, а также ДНК-полимеразы для амплификации полной последовательности ДНК в точном порядке на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, используемых в процессе. Таким образом, это позволяет производить синтетические гены и даже целые синтетические геномы .

Принципы СПС

Подобно тому, как праймеры разрабатываются таким образом, что есть прямой праймер и обратный праймер, позволяющие ДНК-полимеразе заполнить всю матричную последовательность, PCA использует ту же технологию, но с несколькими олигонуклеотидами. В то время как в ПЦР обычно используемый размер олигонуклеотидов составляет 18 пар оснований, в PCA используются длины до 50 для обеспечения уникальности и правильной гибридизации.

Каждый олигонуклеотид спроектирован так, чтобы быть частью верхней или нижней цепи целевой последовательности. Помимо основного требования, заключающегося в возможности укладывать всю целевую последовательность, эти олигонуклеотиды также должны обладать обычными свойствами: схожими температурами плавления, отсутствием шпилек и не слишком богатыми GC, чтобы избежать тех же осложнений, что и ПЦР.

Во время полимеразных циклов олигонуклеотиды отжигаются до комплементарных фрагментов, а затем заполняются полимеразой. Таким образом, каждый цикл случайным образом увеличивает длину различных фрагментов в зависимости от того, какие олигонуклеотиды находят друг друга. Крайне важно, чтобы между всеми фрагментами была каким-то образом комплементарность, иначе окончательная полная последовательность не будет получена, поскольку полимеразе требуется матрица для следования.

После этой начальной фазы конструирования добавляются дополнительные праймеры, охватывающие оба конца, для проведения обычной реакции ПЦР, амплифицирующей целевую последовательность от всех более коротких неполных фрагментов. Затем можно использовать очистку в геле для идентификации и выделения полной последовательности.

Типичная реакция

Типичная реакция состоит из олигонуклеотидов длиной около 50 пар оснований, каждый из которых перекрывается примерно на 20 пар оснований. Затем реакцию со всеми олигонуклеотидами проводят в течение ~30 циклов, а затем еще 23 цикла с концевыми праймерами.

Сборка Гибсона

Модификация этого метода, сборка Гибсона , описанная Гибсоном и др. позволяет осуществлять одностадийную изотермическую сборку ДНК размером до нескольких сотен килооснований . Используя экзонуклеазу Т5 для «пережевывания» комплементарных концов, можно создать перекрытие примерно в 40 п.н. Реакция протекает при 50 °C — температуре, при которой экзонуклеаза Т5 нестабильна. Через короткий промежуток времени он разрушается, перекрытия могут отжигаться и лигироваться. Кембриджского университета Команда IGEM сняла видео, описывающее процесс. Независимое от лигирования клонирование (LIC) — это новый вариант метода объединения нескольких фрагментов ДНК, требующий для реакции только фермента экзонуклеазы.

Ссылки

• Штеммер; и др. (1995). «Одноэтапная сборка гена и всей плазмиды из большого количества олигодезоксирибонуклеотидов». Джин . 164 (1): 49–53. дои : 10.1016/0378-1119(95)00511-4 . ПМИД   7590320 .
• Смит; и др. (2003). «Создание синтетического генома путем сборки всего генома: бактериофаг [var phi] X174 из синтетических олигонуклеотидов» . ПНАС . 100 (26): 15440–15445. дои : 10.1073/pnas.2237126100 . ПМК   307586 . ПМИД   14657399 .