Экстракция геля

В молекулярной биологии гель -экстракция или гель-изоляция — это метод, используемый для выделения желаемого фрагмента интактной ДНК из агарозного геля после электрофореза в агарозном геле . После экстракции интересующие фрагменты можно смешать, преципитировать и ферментативно связать вместе в несколько простых этапов. Этот процесс, обычно выполняемый на плазмидах , является основой элементарной генной инженерии .

После того, как образцы ДНК обрабатываются в агарозном геле, экстракция включает четыре основных этапа: идентификация интересующих фрагментов, выделение соответствующих полос, выделение ДНК из этих полос и удаление сопутствующих солей и красителей.

Вначале гель освещают УФ-светом , чтобы осветить всю ДНК, окрашенную бромидом этидия . Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать воздействия мутагенного излучения на ДНК дольше, чем это абсолютно необходимо. Желаемая полоса идентифицируется и физически удаляется с помощью покровного стекла или бритвенного лезвия . Удаленный кусочек геля должен содержать внутри нужную ДНК. Альтернативный метод, использующий окрашивание геля SYBR Safe DNA и освещение синим светом, позволяет избежать повреждения ДНК, связанного с бромидом этидия и ультрафиолетовым светом.

Существует несколько стратегий выделения и очистки интересующего фрагмента ДНК.

Экстракция на спин-колонке

Наборы для экстракции геля можно приобрести у нескольких крупных производителей биотехнологий, окончательная стоимость которых составляет примерно 1–2 доллара США за образец. Протоколы, включенные в эти наборы, обычно требуют растворения среза геля в 3 объемах хаотропного агента при 50 °C с последующим нанесением раствора на спин-колонку (ДНК остается в колонке), 70% этанол. отмывка (ДНК остается в колонке, соль и примеси вымываются) и элюирование ДНК небольшим объемом (30 мкл) воды или буфера.

Диализ

Фрагмент геля помещают в диализную пробирку , проницаемую для жидкостей, но непроницаемую для молекул размером с ДНК, что предотвращает прохождение ДНК через мембрану при замачивании в буфере ТЕ . Вокруг трубки создается электрическое поле (по аналогии с гель-электрофорезом) на время, достаточное для того, чтобы ДНК удалялась из геля, но оставалась в пробирке. Затем раствор в пробирку можно набрать пипеткой, и он будет содержать нужную ДНК с минимальным фоном.

Традиционный

Традиционный метод экстракции геля предполагает создание сложенного кармана из вощеной бумаги Parafilm и помещение фрагмента агарозы внутрь. Агарозу физически сжимают пальцем в угол кармана, частично разжижая гель и его содержимое. Затем капли жидкости можно направить из кармана на внешнюю часть парафильма, откуда они перекачиваются пипеткой в ​​небольшую трубку. Экстракция бутанолом удаляет пятно бромистого этидия с последующей экстракцией фенолом/хлороформом очищенного фрагмента ДНК.

Недостатком гелевой изоляции является то, что фон можно удалить только в том случае, если его можно физически идентифицировать с помощью УФ-света. Если две полосы расположены очень близко друг к другу, их может быть трудно разделить без загрязнения. Чтобы четко определить интересующую полосу, могут потребоваться дополнительные рестрикционные дайджесты. Сайты рестрикции, уникальные для нежелательных полос одинакового размера, могут помочь разрушить эти потенциальные загрязнения.