Идентификация гибели клеток
Стандарты выявления гибели клеток изменились. Гибель клеток раньше определялась и описывалась на основе морфологии . Сейчас произошел сдвиг в его классификации на основе молекулярных и генетических определений. Это описание более функционально и применимо как к in vitro , так и к in vivo , поэтому процессы гибели клеток теперь описываются рядом точных, измеримых биохимических характеристик. Набор рекомендаций по описанию терминологии клеточной смерти был предложен Номенклатурным комитетом по клеточной смерти (NCCD) в 2009 году, поскольку неправильное использование слов и понятий может замедлить прогресс в области исследований клеточной смерти. [ 1 ]
Классическое определение смерти определяет ее как состояние, характеризующееся прекращением признаков жизни. Это когда клетка потеряла целостность своей плазматической мембраны и/или подверглась полному распаду, включая ядро, и/или ее фрагменты были поглощены соседней клеткой in vivo. Это вызвано необратимым функциональным дисбалансом и коллапсом внутренней организации системы. Роль гибели клеток заключается в поддержании гомеостаза тканей и органов , например, в регулярной потере клеток кожи или в более активной роли, наблюдаемой в инволюции тканей, таких как тимус.
Клетки умирают либо случайно, либо намеренно. Фактически существует два механизма гибели клеток; некроз и апоптоз (апоптоз у беспозвоночных называют делецией клеток). Умирающие клетки участвуют в процессе, который является обратимым до тех пор, пока не будет преодолена первая необратимая фаза или «точка невозврата».
Некроз — это незапрограммированная гибель клеток, которая включает ранние изменения плазматической мембраны, приводящие к потере дисбаланса кальция и натрия. Это вызывает ацидоз, осмотический шок, слипание хроматина и ядерный пикноз . Эти изменения сопровождаются потерей окислительного фосфорилирования , снижением продукции АТФ и потерей гомеостатических способностей. Существуют также митохондриальные изменения, которые включают перегрузку кальцием и активацию фосфолипаз, приводящие к сигналам мембранной диффузии, что является стадией необратимого повреждения. Вторичная стадия включает набухание лизосомы , расширение эндоплазматической сети, утечку ферментов и белков и потерю компартментализации.
Апоптоз, или запрограммированная гибель клеток, обычно характеризуется четкими морфологическими характеристиками и энергозависимыми биохимическими механизмами. Он считается жизненно важным компонентом различных жизненных процессов, включая нормальный клеточный обмен, правильное развитие и функционирование иммунной системы, гормонозависимую атрофию, эмбриональное развитие и химическую смерть клеток. Например, дифференцировка пальцев рук и ног у развивающегося человеческого эмбриона происходит из-за апоптоза клеток между пальцами, в результате чего появляются отдельные пальцы.
Методика гибели клеток
[ редактировать ]| Определение | Примечания | Методы обнаружения 3-5 |
|---|---|---|
| Молекулярные или морфологические критерии определения мертвых клеток | ||
| Потеря целостности плазматической мембраны | Плазматическая мембрана была разрушена, что привело к потере идентичности клетки. | (IF) Микроскопия и/или FACS для оценки выведения жизненно важных красителей in vitro. |
| Фрагментация клеток | Вся клетка подверглась полной фрагментации на отдельные тела (апоптозные тельца). | (ИФ) Микроскопия
Количественная оценка гиподиплоидных явлений с помощью FACS (пик суб-G 1 ) |
| Поглощение соседними клетками | Соседние клетки фагоцитировали труп или его фрагменты. | (ИФ) Микроскопия
Исследования колокализации FACS |
| Предлагаемые точки невозврата для определения умирающих клеток | ||
| Массивная активация каспаз | Классическая программа апоптоза инициируется каспазами, однако в некоторых случаях наступает независимая от каспаз смерть. Более того, каспазы участвуют в других нелетальных процессах, включая дифференцировку и активацию клеток. | Иммуноблоттинг
Количественная оценка FACS с помощью флуорогенных субстратов или специфических антител. |
| расточительство | временная диссипация не всегда является летальным событием, но длительная потеря обычно предшествует MMP и гибели клеток; | Количественная оценка FACS с использованием ΔΨ m -чувствительных зондов. Кальцеин-кобальтовый метод. |
| ММП | Полная ММП приводит к высвобождению летальных катаболических ферментов или активаторов таких ферментов. Тем не менее частичная пермеабилизация не всегда может приводить к гибели клеток. | ЕСЛИ исследования колокализации
Иммуноблоттинг после субклеточного фракционирования |
| PS экспозиция | Ранним событием апоптоза является воздействие ФС на внешний листок плазматической мембраны, но оно может быть обратимым. Воздействие PS происходит также при активации Т-клеток без гибели клеток. | Количественная оценка связывания аннексина V с помощью FACS |
| Оперативное определение гибели клеток, в частности, в исследованиях рака | ||
| Потеря клоногенной выживаемости | Этот метод не позволяет выявить длительную или необратимую остановку клеточного цикла, приводящую к гибели клеток. | Клоногенные анализы |
Морфометрический метод
[ редактировать ]Морфометрический метод — способ продемонстрировать гибель клеток в лаборатории. Морфометрическое измерение дает результат гибели клеток как объем, размер, вес и длину ткани, органа и всего организма, который сравнивается с до и после наступления гибели клеток. [ 2 ] Этот метод наблюдали Аттала и Джонсон, которые использовали анализ электронных частиц для определения жизнеспособности клеток.
Гистохимические и авторадиографические методы.
[ редактировать ]Другим индикатором гибели клеток является кислотный гидролиз, который выделяется в результате пищеварения во время фагоцитоза мертвых клеток макрофагами или соседними клетками, а прижизненный краситель является маркером вторичного фагоцитоза.
Гистологические и цитохимические методы
[ редактировать ]Чтобы продемонстрировать гибель клеток, в некоторых случаях используется витальный краситель , чтобы обнаружить нарушение клеточной функции. В этой процедуре используются живые ткани, которые погружаются в разбавленный раствор нильского голубого сульфата в физиологическом растворе в соотношении 1:0000 . Измерение гибели клеток с помощью этого красителя заключается в наблюдении за изменением цвета или образованием флуоресценции . При гибели клетки ядро проходило стадии разрушения, одна из них - пикноз, приводящие к высвобождению основной группы гистонов , и это происходило при необратимой конденсации хроматинов. Процесс фагоцитоза происходил во вторичных лизосомах, а аутофагия и гетерофагия контролировали мертвые клетки за счет активности кислотного гидролиза. Методы, используемые для объяснения этого, основаны на обнаружении активности (6-3H)-тимидина и кислых фосфатов в криостате.
Процедура
[ редактировать ]Образцу вводили (6-3H)-тимидин, затем ткань удаляли, удаляли через 1 час и гасили жидким азотом. срезы толщиной 4 мкм криостатные Затем вырезали и монтировали на чистые покровные стекла, покровные стекла выдерживали со срезами в криостате, фиксировали в холодном анальном ацетоне в течение 10 минут и покровные стекла промывали в буфере и инкубировали в кисло-фосфатной среде (15 минут). . Нафтол AS TR фосфат [ 3 ] В качестве подложки использовали параосанилин гексазония в качестве связующего. Срезы снова тщательно промывали дистиллированной водой и погружали в авторадиографическую эмульсию (I1ford L4, разбавленный 1:5). Препараты выдерживали при температуре (0-4°С) 2-3 недели в темном помещении. Фотопрепарат обрабатывали, докрашивали гематоксилином и помещали для микроскопии .
Результаты
[ редактировать ]Результатом этого эксперимента является красный цвет, вызванный применением азокрасителя , описанным выше, и это индикатор того, что произошел автолиз клеток. Это и было основной целью морфометрического метода. Другое дело — получение зерен серебра в фотоэмульсии .
Обсуждение
[ редактировать ]Такое изменение цвета обусловлено мелкой гомогенной красной реакцией активности кислой фосфатазы. В лизосомах имеется множество признаков гибели клеток, таких как свободная гидролаза. Включение тритированного тимидина дает зерна серебра в фотоэмульсии, оказавшиеся в ядрах клеток. Идеальной тканью для этой процедуры является ткань тимуса. В качестве примера исследования это обсуждение сосредоточено на двух изменениях, которые происходят в тимусе мыши. Первое изменение — это соотношение умирающих клеток (диффундирующих кислую фосфатазу), а второе — это клетки, включающие тимидин (клетки, синтезирующие ДНК). Результаты сравниваются в зависимости от возраста мыши. После измерения соотношений и чисел был сделан вывод, что уровень гибели клеток в инволюционном тимусе увеличился вдвое по сравнению с молодым тимусом, а тимидин снизился в более старом тимусе по сравнению с молодым тимусом. Для дальнейшего подтверждения этих результатов было обнаружено, что некоторые тимоциты содержали лизосомальные сайты с активностью кислой фосфатазы. Когда макрофаги поглощали умирающие клетки, уровень кислой фосфатазы повышался.
Техника авторадиографии с гистологическим окрашиванием
[ редактировать ]Льюис использовал авторадиографическое включение 3H-тимидина для расчета митотических индексов и оценки пикнотических индексов. Этот метод может быть использован для изучения тканевой кинетики опухолей и находит применение в сканирующем электронном микроскопе . [ 4 ]
Сканирующая электронная микроскопия
[ редактировать ]Сканирующий электронный микроскоп был использован Ходжесом и Мьюиром (1975) для изучения авторадиографа. Этот подход сочетался с цитохимическим методом для демонстрации свободного кислого фосфата и лизиса клеток . Умирающие клетки, богатые свободным кислым фосфатом, будут содержать бромированный продукт реакции и при рентгеновском микроанализе будут давать характерный сигнал для брома . Тонкие структурные исследования В умирающих клетках происходят общие тонкоструктурные изменения. К такому выводу пришли после некоторых попыток таких ученых, как Керр (1972), предложивших общую концепцию апоптоза у позвоночных, а Шевейхель и Меркер (1973) описали индуцированную и физиологическую гибель клеток в тканях пренатальных мышей. Используя тонкие структурные различия, можно распознавать и различать типы гибели клеток. Кислотный фосфат и удаление клеток:
Кислый фосфат представляет собой фермент или группу изоферментов, которые можно использовать для демонстрации гибели клеток, и это можно легко наблюдать с помощью электронного микроскопа. Активность P-нитрофоенилфосфата можно использовать в качестве хорошего маркера гибели клеток. Этот маркер использовался для локализации клеточной гибели в клетках во время эмбриологического развития, и результатом было высвобождение экзоплазматического нелизосомального кислого фосфата. Это выглядит как признак гибели клеток. Есть много экспериментов, показывающих, что высвободившийся эктоплазматический п-нитрофоенилфосфат связан с рибосомами, а не с лизосомами.
Синтез ДНК, РНК и белка при гибели клеток
[ редактировать ]Запрограммированная гибель клеток означает генетический контроль над процессом, поэтому в последовательности развития должны присутствовать гены, определяющие гибель клеток. Многие авторы показывают, что может наблюдаться предварительное увеличение синтеза белка в качестве предпосылки для запрограммированной гибели клеток.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Кремер, Г., Галлуцци, Л., Ванденабили, П., Абрамс, Дж., Алнемри, Э., Бэхреке, Э.,… Мелино, Г. (2009). «Классификация гибели клеток: рекомендации Номенклатурного комитета по гибели клеток 2009». Смерть клеток и дифференцировка , 16 (1), 3–11. ( http://doi.org/10.1038/cdd.2008.150 .)
- ^ Британская энциклопедия . (2015). «Гомеостаз» . По состоянию на 22 декабря 2016 г.
- ^ 2016. «Нафтол фосфат AS-TR» . По состоянию на 29 декабря 2016 г.
- ^ I. Дэвис и Д.С. Сиги (1984) Старение клеток и гибель клеток . Страницы 5–32. Издательство Кембриджского университета, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк.