Расширение праймера

Обзор расширения праймера. В представляющей интерес транскрипте урацил имеет значение +1 (неизвестно до анализа). 2) Синтезируйте праймер, меченный на 5'-конце (используя [γ32P] АТФ. 3) Создайте кДНК, расширив праймер с обратной транскриптазой до 5'-конца транскрипта. 4) Результатом является радиоактивно меченная расширенная кДНК праймера, которая денатурируется и отделяется на полиакриламидном геле и обнаруживается авторадиографией. Обычно на геле находится лестница секвенирования с использованием того же праймера, что позволяет быстро идентифицировать нуклеотид +1 (показан фиолетовым цветом).

Расширение праймера это метод, с помощью которого можно картировать 5'-концы РНК — , то есть секвенировать их и правильно идентифицировать.

Расширение праймера можно использовать для определения стартового сайта транскрипции (конечный сайт не может быть определен этим методом), по которому известна его последовательность. Для этого метода требуется меченный радиоактивным изотопом праймер (обычно длиной 20–50 нуклеотидов), который комплементарен участку вблизи 3'-конца мРНК. Праймеру дают возможность отжигаться с РНК, а обратная транскриптаза используется для синтеза кДНК из РНК до тех пор, пока она не достигнет 5'-конца РНК. Денатурируя гибрид и используя кДНК расширенного праймера в качестве маркера на электрофоретическом геле, можно определить сайт начала транскрипции . Обычно это делается путем сравнения его местоположения на геле с последовательностью ДНК (например, секвенированием по Сэнгеру ), предпочтительно с использованием того же праймера на цепи матрицы ДНК. Точный нуклеотид, с которого начинается транскрипция, можно определить путем сопоставления меченого расширенного праймера с маркерным нуклеотидом, которые оба имеют одинаковое расстояние миграции в геле.

Расширение праймера предлагает альтернативу анализу защиты нуклеазы (картирование нуклеазы S1) для количественного определения и картирования транскриптов РНК. Гибридизационный зонд для удлинения праймера представляет собой синтезированный олигонуклеотид, тогда как для картирования S1 требуется выделение фрагмента ДНК. Оба метода предоставляют информацию о том, где начинается мРНК, и позволяют оценить концентрацию транскрипта по интенсивности полосы транскрипта на полученной авторадиограмме. Однако, в отличие от картирования S1, удлинение праймера можно использовать только для обнаружения 5'-конца транскрипта мРНК, поскольку синтез ДНК, необходимый для анализа, основан на обратной транскриптазе (полимеризуется только в направлении 5' → 3').

На расширение праймера не влияют сайты сплайсинга, и поэтому он предпочтителен в ситуациях, когда промежуточные сайты сплайсинга препятствуют картированию S1. Наконец, удлинение праймера является более точным, чем картирование S1, поскольку нуклеаза S1 , используемая при картировании S1, может «откусывать» концы гибрида РНК-ДНК или не полностью разрушать одноцепочечные области, в результате чего транскрипт становится либо короче, либо длиннее.

Ссылки

• https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/primer-extension
• Шенк, Т.Э., К. Роудс, П.В.Дж. Ригби и П. Берг. «Биохимическая процедура получения небольших делеций в ДНК обезьяньего вируса 40». Труды Национальной академии наук 72.4 (1975): 1392–396. Распечатать.