Дополнительная ДНК
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( октябрь 2010 г. ) |
В генетике , комплементарная ДНК ( кДНК ) — это ДНК которая была обратно транскрибирована (посредством обратной транскриптазы ) с РНК (например, информационной РНК или микроРНК ). кДНК существует как в одноцепочечной , так и в двухцепочечной формах, а также в природной и сконструированной формах.
В сконструированных формах это часто копия (реплика) встречающейся в природе ДНК из естественного генома какого-либо конкретного организма; собственная мРНК организма естественным образом транскрибируется с его ДНК, а кДНК подвергается обратной транскрипции с мРНК, в результате чего образуется дубликат исходной ДНК. Сконструированная кДНК часто используется для экспрессии определенного белка в клетке, которая обычно не экспрессирует этот белок (т.е. гетерологичная экспрессия), или для секвенирования или количественного определения молекул мРНК с использованием методов на основе ДНК (qPCR, RNA-seq). кДНК, кодирующая определенный белок, может быть перенесена в клетку-реципиент для экспрессии как часть рекомбинантной ДНК , часто бактериальной или дрожжевой системы экспрессии. [1] кДНК также генерируется для анализа транскриптомных профилей в объемной ткани, отдельных клетках или отдельных ядрах в таких анализах, как микрочипы , qPCR и секвенирование РНК .
В естественных формах кДНК вырабатывается ретровирусами (такими как ВИЧ-1 , ВИЧ-2 , вирус иммунодефицита обезьян и т. д.), а затем интегрируется в геном хозяина, где создает провирус . [2]
Термин кДНК также используется, обычно в контексте биоинформатики , для обозначения последовательности транскрипта мРНК, выраженной в виде оснований ДНК (дезокси-GCAT), а не оснований РНК (GCAU).
Патентоспособность кДНК была предметом решения Верховного суда США в 2013 году по делу Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics, Inc. В качестве компромисса суд заявил, что кДНК, состоящая только из экзонов, подлежит патентованию, тогда как изолированные последовательности ДНК природного происхождения содержащие интроны, таковыми не являются.
Синтез [ править ]
РНК служит матрицей для синтеза кДНК. [3] В клеточной жизни кДНК генерируется вирусами и ретротранспозонами для интеграции РНК в целевую геномную ДНК . В молекулярной биологии РНК очищают из исходного материала после удаления геномной ДНК, белков и других клеточных компонентов. кДНК затем синтезируется посредством in vitro обратной транскрипции . [4]
Очистка РНК [ править ]
РНК транскрибируется из геномной ДНК в клетках-хозяевах и экстрагируется путем сначала лизиса клеток, а затем очистки РНК с использованием широко используемых методов, таких как фенол-хлороформ, колонка с диоксидом кремния и методы экстракции РНК на основе шариков. [5] Методы экстракции различаются в зависимости от исходного материала. Например, для извлечения РНК из растительной ткани требуются дополнительные реагенты, такие как поливинилпирролидон (ПВП), для удаления фенольных соединений, углеводов и других соединений, которые в противном случае сделают РНК непригодной для использования. [6] Для удаления ДНК и белков для деградации используются такие ферменты, как ДНКаза и протеиназа К. [7] Важно отметить, что целостность РНК поддерживается путем инактивации РНКаз хаотропными агентами, такими как изотиоцианат гуанидиния, додецилсульфат натрия (SDS), фенол или хлороформ. Затем тотальную РНК отделяют от других клеточных компонентов и осаждают спиртом. Существуют различные коммерческие наборы для простого и быстрого выделения РНК для конкретных применений. [8] Дополнительные методы на основе шариков можно использовать для выделения конкретных подтипов РНК (например, мРНК и микроРНК ) в зависимости от размера или уникальных участков РНК. [9] [10]
Обратная транскрипция [ править ]
первой Синтез цепи
Используя фермент обратной транскриптазы и очищенные матрицы РНК, получают одну цепь кДНК (синтез первой цепи кДНК). Обратная транскриптаза M-MLV из вируса мышиного лейкоза Молони обычно используется из-за ее пониженной активности РНКазы H, подходящей для транскрипции более длинных РНК. [11] Обратная транскриптаза AMV из вируса миелобластоза птиц также может быть использована для матриц РНК с сильными вторичными структурами (т.е. с высокой температурой плавления). [12] кДНК обычно получают из мРНК для анализа экспрессии генов, такого как RT-qPCR и RNA-seq . [13] мРНК избирательно обратно транскрибируется с использованием олиго-d Т -праймеров, которые являются обратным комплементом полиаденилированного хвоста на 3'-конце всей мРНК. Праймер олиго-dT отжигается с полиаденилированным хвостом мРНК и служит местом связывания обратной транскриптазы для начала обратной транскрипции. Оптимизированная смесь олиго-дТ и случайных гексамерных праймеров увеличивает вероятность получения полноразмерной кДНК, одновременно уменьшая 5'- или 3'-систематическую ошибку. [14] Рибосомальная РНК также может быть истощена для обогащения как мРНК, так и неполиаденилированных транскриптов, таких как некоторые некодирующие РНК . [15]
второй Синтез цепи
Результат синтеза первой цепи, гибриды РНК-ДНК, можно обрабатывать с помощью нескольких методов синтеза второй цепи или обрабатывать непосредственно в последующих анализах. [16] [17] Ранний метод, известный как синтез со шпилькой, основывался на образовании шпильки на 3'-конце кДНК первой цепи для запуска синтеза второй цепи. Однако прайминг носит случайный характер, и гидролиз шпилек приводит к потере информации. Процедура Гублера и Хоффмана использует РНКазу H E. Coli для разрыва мРНК, которая заменяется ДНК-полимеразой I E. Coli и запечатывается ДНК-лигазой E. Coli . Оптимизация этой процедуры основана на низкой активности РНКазы H M-MLV для разрыва мРНК, а оставшаяся РНК позже удаляется путем добавления РНКазы H после трансляции ДНК-полимеразы второй цепи кДНК. Это предотвращает потерю информации о последовательности на 5'-конце мРНК.
Приложения [ править ]
Комплементарная ДНК часто используется при клонировании генов , в качестве генных зондов или при создании библиотеки кДНК . Когда ученые переносят ген из одной клетки в другую, чтобы экспрессировать новый генетический материал в виде белка в клетке-реципиенте, к реципиенту будет добавлена кДНК (а не весь ген), поскольку ДНК для всего гена может включать ДНК, которая не кодирует белок или прерывает кодирующую последовательность белка (например, интроны ). Частичные последовательности кДНК часто получают в виде меток экспрессируемых последовательностей .
Поскольку амплификация последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) сейчас стала обычным явлением, на начальном этапе обычно проводят обратную транскрипцию с последующей ПЦР для получения точной последовательности кДНК для внутриклеточной экспрессии. Это достигается путем создания специфичных для последовательности праймеров ДНК, которые гибридизуются с 5'- и 3'-концами участка кДНК, кодирующего белок. После амплификации последовательность можно разрезать на каждом конце с помощью нуклеаз и вставить в одну из множества небольших кольцевых последовательностей ДНК, известных как векторы экспрессии. Такие векторы обеспечивают саморепликацию внутри клеток и потенциально интеграцию в ДНК хозяина. Обычно они также содержат сильный промотор, который управляет транскрипцией целевой кДНК в мРНК, которая затем транслируется в белок.
кДНК также используется для изучения экспрессии генов с помощью таких методов, как RNA-seq или RT-qPCR . [18] [19] [20] Для секвенирования РНК должна быть фрагментирована из-за ограничений размера платформы секвенирования. Кроме того, синтезированную кДНК второй цепи необходимо лигировать с адаптерами, которые позволяют фрагментам кДНК амплифицироваться с помощью ПЦР и связываться с проточными клетками для секвенирования. В методах ген-специфического анализа обычно используются микрочипы и RT-qPCR для количественного определения уровней кДНК с помощью флуорометрических и других методов.
13 июня 2013 года Верховный суд США постановил по делу Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics , что, хотя встречающиеся в природе гены не могут быть запатентованы , кДНК подлежит патентованию, поскольку она не встречается в природе. [21]
Вирусы и ретротранспозоны [ править ]
Некоторые вирусы также используют кДНК для превращения своей вирусной РНК в мРНК (вирусная РНК → кДНК → мРНК). мРНК используется для того, чтобы вирусные белки захватили клетку-хозяина.
Пример этого первого шага от вирусной РНК к кДНК можно увидеть в цикле заражения ВИЧ. Здесь мембрана клетки-хозяина прикрепляется к липидной оболочке вируса, что позволяет вирусному капсиду с двумя копиями РНК вирусного генома проникнуть в хозяина. Копия кДНК затем создается посредством обратной транскрипции вирусной РНК - процесса, которому способствуют шаперон CypA и обратная транскриптаза, связанная с вирусным капсидом. [22]
кДНК также генерируется ретротранспозонами в геномах эукариот. Ретротранспозоны — это мобильные генетические элементы, которые перемещаются внутри, а иногда и между геномами через промежуточные РНК. Этот механизм является общим с вирусами, за исключением образования инфекционных частиц. [23] [24]
См. также [ править ]
- Библиотека кДНК - Тип библиотеки ДНК
- Микрочип кДНК – коллекция микроскопических пятен ДНК, прикрепленных к твердой поверхности.
- RNA-Seq - Лабораторный метод клеточной биологии
- Полимеразная цепная реакция в реальном времени – Лабораторный метод молекулярной биологии (RT-qPCR)
Ссылки [ править ]
Марк Д. Адамс и др. «Дополнительное секвенирование ДНК: метки выраженных последовательностей и проект генома человека». Наука (Американская ассоциация содействия развитию науки) 252.5013 (1991): 1651–1656. Веб.
Филип М. Мерфи и Х. Ли Тиффани. «Клонирование дополнительной ДНК, кодирующей функциональный рецептор интерлейкина-8 человека». Наука (Американская ассоциация содействия развитию науки) 253.5025 (1991): 1280–1283. Веб.
- ^ Гастингс, П.Дж. (1 января 2001 г.), «Комплементарная ДНК (кДНК)» , в Бреннере, Сидней; Миллер, Джеффри Х. (ред.), Энциклопедия генетики , Нью-Йорк: Academic Press, стр. 433, ISBN 978-0-12-227080-2 , получено 29 ноября 2022 г.
- ^ Крой, Рон. «Молекулярная генетика II - Курс генной инженерии (дополнительные примечания)» . Даремский университет durham.ac.uk; 20 апреля 1998 года . Архивировано из оригинала 24 августа 2002 года . Проверено 4 февраля 2015 г.
- ^ Ин, Шао-Яо (1 июля 2004 г.). «Дополнительные библиотеки ДНК». Молекулярная биотехнология . 27 (3): 245–252. дои : 10.1385/МБ:27:3:245 . ISSN 1559-0305 . ПМИД 15247497 . S2CID 25600775 .
- ^ «5 шагов к оптимальному синтезу кДНК - США» . www.thermofisher.com . Проверено 12 мая 2020 г.
- ^ Таварес, Луселия; Алвес, Паула М.; Феррейра, Рикардо Б.; Сантос, Клаудия Н. (6 января 2011 г.). «Сравнение различных методов выделения РНК без ДНК из нейробластомы SK-N-MC» . Исследовательские заметки BMC . 4 (1): 3. дои : 10.1186/1756-0500-4-3 . ISSN 1756-0500 . ПМК 3050700 . ПМИД 21211020 .
- ^ Р, Кансал; К, Кухар; Я, Верма; Рн, Гупта; Вк, Гупта; Кр, Кундал (декабрь 2008 г.). «Улучшенный и удобный метод выделения РНК из полифенолов и богатых полисахаридами растительных тканей». Индийский журнал экспериментальной биологии . 46 (12): 842–5. ПМИД 19245182 .
- ^ Я, Вомелова; З, Ваницкова; А, Седо (2009). «Методы очистки РНК. Все пути (должны) вести в Рим». Фолиа Биологика . 55 (6): 243–51. ПМИД 20163774 .
- ^ Селлин Джеффрис, Марло К.; Поцелуй, Андор Дж.; Смит, Остин В.; Орис, Джеймс Т. (14 ноября 2014 г.). «Сравнение имеющихся в продаже наборов для автоматической и ручной экстракции для выделения тотальной РНК из небольших образцов тканей» . БМК Биотехнология . 14 (1): 94. дои : 10.1186/s12896-014-0094-8 . ISSN 1472-6750 . ПМЦ 4239376 . ПМИД 25394494 .
- ^ «Выделение мРНК с помощью Dynabeads за 15 минут - США» . www.thermofisher.com . Проверено 20 мая 2020 г.
- ^ Гаарц, Андреа; Дебей-Пашер, Свенья; Классен, Сабина; Эггл, Даниэла; Гатхоф, Биргит; Чен, Цзин; Фань, Цзянь-Бин; Восс, Торстен; Шульце, Иоахим Л.; Старачек-Йокс, Андреа (май 2010 г.). «Профилирование экспрессии микроРНК в периферической крови на основе Bead Array и влияние различных подходов к выделению РНК» . Журнал молекулярной диагностики . 12 (3): 335–344. дои : 10.2353/jmoldx.2010.090116 . ISSN 1525-1578 . ПМК 2860470 . ПМИД 20228267 .
- ^ Хаддад, Фадия; Болдуин, Кеннет М. (2010), Кинг, Никола (редактор), «Обратная транскрипция рибонуклеиновой кислоты: первый шаг в анализе RT-PCR», Протоколы RT-PCR: второе издание , Methods in Molecular Biology, vol. 630, Humana Press, стр. 261–270, номер документа : 10.1007/978-1-60761-629-0_17 , ISBN. 978-1-60761-629-0 , ПМИД 20301003
- ^ Мартин, Карен. «Обзор и применение обратной транскриптазы и кДНК» . Золотая биотехнология . Проверено 20 мая 2020 г.
- ^ «КПЦР, микрочипы или секвенирование РНК – что выбрать?» . БиоСистемика . 10 августа 2017 года . Проверено 20 мая 2020 г.
- ^ «Синтез кДНК | Био-Рад» . www.bio-rad.com . Проверено 28 мая 2020 г.
- ^ Герберт, Закари Т.; Кершнер, Джейми П.; Батти, Винсент Л.; Тиммапурам, Джьоти; Чоудхари, Сулбха; Алексеев Юрий О.; Фан, Джун; Поднар, Джессика В.; Уилкокс, Эдвард; Гипсон, Дженни; Гилласпи, Эллисон (15 марта 2018 г.). «Межсайтовое сравнение наборов для истощения рибосом для создания библиотеки Illumina RNAseq» . БМК Геномика . 19 (1): 199. дои : 10.1186/s12864-018-4585-1 . ISSN 1471-2164 . ПМК 6389247 . ПМИД 29703133 .
- ^ Инвитроген. «Система синтеза кДНК» (PDF) . Термофишер . Архивировано (PDF) из оригинала 22 декабря 2018 года . Проверено 27 мая 2020 г.
- ^ Агарвал, Саураб; Макфарлан, Тодд С.; Сартор, Морин А.; Ивасе, Сигеки (21 января 2015 г.). «Секвенирование библиотеки кДНК первой цепи позволяет выявить полноразмерные транскриптомы» . Природные коммуникации . 6 (1): 6002. Бибкод : 2015NatCo...6.6002A . дои : 10.1038/ncomms7002 . ISSN 2041-1723 . ПМК 5054741 . ПМИД 25607527 .
- ^ Дериси, Дж.; Пенленд, Л.; Браун, ПО; Биттнер, МЛ; Мельцер, П.С.; Рэй, М.; Чен, Ю.; Су, Ю.А.; Трент, Дж. М. (декабрь 1996 г.). «Использование микрочипа кДНК для анализа закономерностей экспрессии генов при раке человека» . Природная генетика . 14 (4): 457–460. дои : 10.1038/ng1296-457 . ISSN 1546-1718 . ПМИД 8944026 . S2CID 23091561 .
- ^ Уайт, Адам К.; ВанИнсберг, Майкл; Петрив Олег Игоревич; Хамиди, Мани; Сикорский, Дарек; Марра, Марко А.; Пирет, Джеймс; Апарисио, Самуэль; Хансен, Карл Л. (23 августа 2011 г.). «Высокопроизводительная микрофлюидная одноклеточная RT-qPCR» . Труды Национальной академии наук . 108 (34): 13999–14004. Бибкод : 2011PNAS..10813999W . дои : 10.1073/pnas.1019446108 . ISSN 0027-8424 . ПМК 3161570 . ПМИД 21808033 .
- ^ Хрдличкова, Радмила; Толуэ, Масуд; Тиан, Бин (январь 2017 г.). «Методы RNA-Seq для анализа транскриптома» . Междисциплинарные обзоры Wiley. РНК . 8 (1): e1364. дои : 10.1002/wrna.1364 . ISSN 1757-7004 . ПМЦ 5717752 . ПМИД 27198714 .
- ^ Липтак, Адам (13 июня 2013 г.). «Верховный суд постановил, что человеческие гены не могут быть запатентованы» . Нью-Йорк Таймс . Архивировано из оригинала 1 января 2022 года . Проверено 14 июня 2013 г.
- ^ Альтфельд, Маркус; Гейл, Майкл младший (1 июня 2015 г.). «Врожденный иммунитет против инфекции ВИЧ-1» . Природная иммунология . 16 (6): 554–562. дои : 10.1038/ni.3157 . ISSN 1529-2908 . ПМИД 25988887 . S2CID 1577651 .
- ^ Хавекер, Эрика Р.; Гао, Сян; Войтас, Дэниел Ф. (18 мая 2004 г.). «Разнообразие ретротранспозонов LTR» . Геномная биология . 5 (6): 225. doi : 10.1186/gb-2004-5-6-225 . ISSN 1474-760X . ПМК 463057 . ПМИД 15186483 .
- ^ Кордо, Ришар; Батцер, Марк А. (октябрь 2009 г.). «Влияние ретротранспозонов на эволюцию генома человека» . Обзоры природы Генетика . 10 (10): 691–703. дои : 10.1038/nrg2640 . ISSN 1471-0064 . ПМК 2884099 . ПМИД 19763152 .
Внешние ссылки [ править ]
Виды нуклеиновых кислот | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Составляющие | |||||||
| Рибонуклеиновые кислоты (кодирование, некодирование ) |
| ||||||
| Дезоксирибонуклеиновая кислоты | |||||||
| Аналоги | |||||||
| Клонирование векторов | |||||||
