✖


Jump to content

Дрожжевая искусственная хромосома

Эта статья о хромосомах, полученных из ДНК дрожжей. Информацию о дрожжах, созданных из синтетической ДНК, см. в разделе «Синтетическая ДНК» .

Дрожжевые искусственные хромосомы (YAC) представляют собой генно-инженерные хромосомы, полученные из ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae [1] , которая затем лигируется в бактериальную плазмиду. Вставив большие фрагменты ДНК размером от 100 до 1000 т.п.н., вставленные последовательности можно клонировать и физически картировать с помощью процесса, называемого хромосомным блужданием . Этот процесс первоначально использовался в проекте «Геном человека» , однако из-за проблем со стабильностью от YAC отказались в пользу использования бактериальной искусственной хромосомы [2].

Пекарские дрожжи S. cerevisiae — один из важнейших экспериментальных организмов для изучения молекулярной генетики эукариот. [1]

Начиная с первоначальных исследований Ранкина и др., Струла и др. и Хсайо и др., хрупкая по своей природе хромосома была стабилизирована путем открытия необходимой автономно реплицирующейся последовательности (ARS); [2] усовершенствованный YAC, использующий эти данные, был описан в 1983 году Мюрреем и др. [3]

Основными компонентами YAC являются ARS, центромера [3] и теломеры [4] из S. cerevisiae . Кроме того, для отбора трансформированных дрожжевых клеток используются селектируемые маркерные гены, такие как устойчивость к антибиотикам и видимый маркер. Без этих последовательностей хромосома не будет стабильной во время внеклеточной репликации и ее нельзя будет отличить от колоний без вектора. [4]

Это фотография двух экземпляров библиотеки YAC генома человека Вашингтонского университета. Каждый из стопок состоит примерно из 12 микротитровальных планшетов. В каждом планшете имеется 96 лунок, каждая из которых содержит разные клоны дрожжей.

Строительство

[ редактировать ]

YAC строится с использованием исходной кольцевой ДНК- плазмиды , которую обычно разрезают на линейную молекулу ДНК с помощью ферментов рестрикции ; Затем ДНК-лигаза используется для лигирования интересующей последовательности ДНК или гена в линеаризованную ДНК, образуя один большой кольцевой фрагмент ДНК. [3] [5] Базовое поколение линейных искусственных хромосом дрожжей можно разбить на 6 основных этапов:

  1. Лигирование селектируемого маркера в плазмидный вектор: это позволяет проводить дифференциальный отбор колоний с маркерным геном или без него. Ген устойчивости к антибиотикам позволяет амплифицировать и отбирать вектор YAC в E. coli , сохраняя способность мутантной E. coli синтезировать лейцин в присутствии необходимых компонентов в питательной среде. TRP1 и URA3 Гены являются другими селектируемыми маркерами. Сайт клонирования вектора YAC для чужеродной ДНК расположен внутри гена SUP4 . Этот ген компенсирует мутацию в дрожжевой клетке-хозяине, вызывающую накопление красного пигмента. Клетки-хозяева обычно красные, а клетки, трансформированные только YAC, образуют бесцветные колонии. Клонирование чужеродного фрагмента ДНК в YAC вызывает инсерционную инактивацию гена, восстанавливая красный цвет. Поэтому колонии, содержащие чужеродный фрагмент ДНК, имеют красный цвет. [5]
  2. Лигирование необходимых центромерных последовательностей для митотической стабильности. [6]
  3. Лигирование автономно реплицирующихся последовательностей (ARS), обеспечивающее начало репликации для митотической репликации. Это позволяет плазмиде реплицироваться внехромосомно, но делает плазмиду очень митотически нестабильной и легко теряется без центромерных последовательностей. [4] [7]
  4. Лигирование искусственных теломерных последовательностей для преобразования кольцевой плазмиды в линейный фрагмент ДНК. [8]
  5. Вставка последовательности ДНК для амплификации (до 1000 КБ)
  6. Трансформация дрожжевой колонии [9]

Полная хромосома III

[ редактировать ]

Хромосома III — третья по размеру хромосома S. cerevisiae; его размер был оценен на основе исследований гель-электрофореза в импульсном поле и составил 300–360 кб. [10]

Эта хромосома стала предметом интенсивного изучения, не в последнюю очередь потому, что она содержит три генетических локуса, участвующих в контроле типа спаривания: MAT, HML и HMR. [11] В марте 2014 года Джеф Буке из Медицинского центра Лангоне при Нью-Йоркском университете опубликовал информацию о том, что его команда синтезировала одну из 16 дрожжевых хромосом S. cerevisiae , хромосому III, которую он назвал SynIII . [12] [13] Процедура включала замену генов в исходной хромосоме синтетическими версиями, а готовую синтезированную хромосому затем интегрировали в дрожжевую клетку. Для этого потребовалось спроектировать и создать 273 871 пару оснований ДНК — меньше, чем 316 667 пар оснований в исходной хромосоме.

Использование в биотехнологии

[ редактировать ]

Дрожжевые векторы экспрессии, такие как YAC, YIps (дрожжевые интегрирующие плазмиды) и YEps (дрожжевые эписомальные плазмиды), имеют преимущество перед бактериальными искусственными хромосомами (BAC) в том, что их можно использовать для экспрессии эукариотических белков, требующих посттрансляционной модификации . Имея возможность вставлять большие фрагменты ДНК, YAC можно использовать для клонирования и сборки целых геномов организма. [14] При вставке YAC в дрожжевые клетки их можно размножать как линейные искусственные хромосомы, при этом клонируя вставленные области ДНК. После этого можно использовать два процесса для получения секвенированного генома или интересующей области:

  1. Физическое картографирование [6]
  2. Хромосомная ходьба [15]

Это важно, поскольку позволяет детально картировать определенные области генома. Были исследованы целые хромосомы человека, такие как Х-хромосома, [16] определение местоположения генетических маркеров многочисленных генетических нарушений и признаков. [17]

Схема плазмиды pBR322, созданной в лаборатории Бойера в Калифорнийском университете в Сан-Франциско Боливаром и Родригесом в 1972 году. Это один из первых и наиболее широко используемых векторов, а также основа для YAC, созданных Мюрреем и Шостаком в 1983 году. Плазмида содержит ампициллин. и гены устойчивости к тетрациклину, а также набор сайтов-мишеней ферментов рестрикции для встраивания фрагментов ДНК.

Проект «Геном человека»

[ редактировать ]

В Соединенных Штатах проект «Геном человека» впервые принял четкую форму в феврале 1988 года, когда Национальный исследовательский совет (NRC) опубликовал отчет «Картирование и секвенирование генома человека». [18] YAC значительно менее стабильны, чем BAC, создавая «химерные эффекты»: артефакты, при которых последовательность клонированной ДНК фактически соответствует не одной геномной области, а нескольким областям. Химеризм может быть обусловлен либо совмещением нескольких геномных сегментов в один YAC, либо рекомбинацией двух или более YAC, трансформированных в одной и той же дрожжевой клетке-хозяине. [19] Частота химеризма может достигать 50%. [20] Другими артефактами являются удаление сегментов из клонированной области и перестановка геномных сегментов (например, инверсия). Во всех этих случаях последовательность, определенная по клону YAC, отличается от исходной естественной последовательности, что приводит к противоречивым результатам и ошибкам в интерпретации, если полагаться на информацию клона. Из-за этих проблем проект «Геном человека» в конечном итоге отказался от использования YAC и переключился на бактериальные искусственные хромосомы , где частота возникновения этих артефактов очень низка. Помимо проблем со стабильностью, в частности относительно частого возникновения химерных событий, YAC оказались неэффективными при создании минимального пути мозаики, охватывающего весь геном человека. Создание библиотек клонов занимает много времени. Кроме того, из-за характера использования сайтов с мечеными последовательностями (STS) в качестве ориентира при выборе подходящих клонов, существуют большие пробелы, которые требуют дальнейшего создания библиотек для заполнения. Именно это дополнительное препятствие побудило проект вместо этого использовать BAC. [21] Это связано с двумя факторами: [22]

  1. BAC создаются гораздо быстрее, и это важно при создании избыточных библиотек клонов.
  2. BAC обеспечивают более плотное покрытие STS, что приводит к более полным и эффективным минимальным путям мозаики, генерируемым in silico.

Однако можно использовать оба подхода, как было продемонстрировано при изучении генома нематоды C. elegans . Там большая часть генома была выложена BAC, а пробелы заполнены YAC. [21]

См. также

[ редактировать ]

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Молекулярная биология дрожжей Saccharomyces: метаболизм и экспрессия генов . Колд-Спринг-Харбор, Нью-Йорк: Лаборатория Колд-Спринг-Харбор. 1982. ISBN  0-87969-149-2 .
  2. ^ Сяо CL, Carbon J (август 1979 г.). «Высокочастотная трансформация дрожжей плазмидами, содержащими клонированный дрожжевой ген ARG4» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 76 (8): 3829–33. Бибкод : 1979PNAS...76.3829H . дои : 10.1073/pnas.76.8.3829 . ПМЦ   383928 . ПМИД   386351 .
  3. ^ Jump up to: а б Мюррей А.В., Шостак Дж.В. (1983). «Конструирование искусственных хромосом у дрожжей». Природа . 305 (5931): 189–93. Бибкод : 1983Natur.305..189M . дои : 10.1038/305189a0 . ПМИД   6350893 . S2CID   4337825 .
  4. ^ Jump up to: а б Рацкин Б., Карбон Дж. (февраль 1977 г.). «Функциональная экспрессия клонированной ДНК дрожжей в Escherichia coli» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 74 (2): 487–91. Бибкод : 1977ПНАС...74..487Р . дои : 10.1073/pnas.74.2.487 . ПМЦ   392314 . ПМИД   322128 .
  5. ^ Страчан Т. (2011). Молекулярная генетика человека / Том Страчан и Эндрю Рид, 4-е изд.
  6. ^ Кларк Л., Карбон Дж. (октябрь 1980 г.). «Выделение центромеры дрожжей и построение функциональных малых кольцевых хромосом». Природа . 287 (5782): 504–9. Бибкод : 1980Natur.287..504C . дои : 10.1038/287504a0 . ПМИД   6999364 . S2CID   4348814 .
  7. ^ Струл К., Стинчкомб Д.Т., Шерер С., Дэвис Р.В. (март 1979 г.). «Высокочастотная трансформация дрожжей: автономная репликация гибридных молекул ДНК» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 76 (3): 1035–9. Бибкод : 1979PNAS...76.1035S . дои : 10.1073/pnas.76.3.1035 . ПМЦ   383183 . ПМИД   375221 .
  8. ^ Кисс ГБ, Амин А.А., Перлман Р.Э. (июнь 1981 г.). «Два отдельных участка внехромосомной рибосомальной дезоксирибонуклеиновой кислоты Tetrahymena thermophila обеспечивают автономную репликацию плазмид в Saccharomyces cerevisiae» . Молекулярная и клеточная биология . 1 (6): 535–43. дои : 10.1128/mcb.1.6.535 . ПМК   369696 . ПМИД   6765606 .
  9. ^ Берк Д.Т., Карл Г.Ф., Олсон М.В. (май 1987 г.). «Клонирование больших сегментов экзогенной ДНК в дрожжи с помощью искусственных хромосомных векторов». Наука . 236 (4803): 806–12. Бибкод : 1987Sci...236..806B . дои : 10.1126/science.3033825 . ПМИД   3033825 .
  10. ^ Оливер, SG; и др. (май 1992 г.). «Полная последовательность ДНК дрожжевой хромосомы III». Природа . 357 (6373): 38–46. Бибкод : 1992Natur.357...38O . дои : 10.1038/357038a0 . ПМИД   1574125 . S2CID   4271784 .
  11. ^ Стратерн, Дж. Н., Ньюлон, К. С., Херсковиц, И. и Хикс, Дж. Б. (май 1992 г.). «Полная последовательность ДНК дрожжевой хромосомы III». Природа . Клетка. 18 (6373) (опубликовано в 1979 г.): 309–319. Бибкод : 1992Natur.357...38O . дои : 10.1038/357038a0 . ПМИД   1574125 . S2CID   4271784 . {{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  12. ^ Шукман, Дэвид (27 марта 2014 г.). «Ученые приветствуют прогресс синтетических хромосом» . Новости Би-би-си . Проверено 28 марта 2014 г.
  13. ^ 24674868 Анналуру Н., Мюллер Х., Митчелл Л.А., Рамалингам С., Стракваданио Г., Ричардсон С.М. и др. (апрель 2014 г.). «Полный синтез функционального конструктора эукариотической хромосомы» . Наука 344 (6179): 55–8. Бибкод : 2014Наука...344... 55А дои : 10.1126/science.1249252 . ПМЦ   4033833 . ПМИД   24674868 .
  14. ^ Берк Д., Карл Г. и Олсон М. Клонирование больших сегментов экзогенной ДНК в дрожжи с помощью искусственных хромосомных векторов. Science 236, 806–812 (1987).
  15. ^ Кере, Дж.; Нагараджа, Р.; Мумм, С.; Чиккодикола, А.; Д'Урсо, М. (1992). «Картирование хромосом человека путем прогулки по сайтам с мечеными последовательностями из концевых фрагментов вставок искусственных хромосом дрожжей». Геномика . 14 (2): 241–248. дои : 10.1016/s0888-7543(05)80212-5 . ПМИД   1427839 .
  16. ^ Росс, Монтана; и др. (2005). «Последовательность ДНК Х-хромосомы человека» . Природа . 434 (7031): 325–337. Бибкод : 2005Natur.434..325R . дои : 10.1038/nature03440 . ПМЦ   2665286 . ПМИД   15772651 .
  17. ^ Петрухин К., Фишер С.Г., Пирасту М., Танци Р.Э., Чернов И., Девото М., Бжустович Л.М., Кайанис Э., Витале Е., Руссо Дж.Дж. (декабрь 1993 г.). «Картирование, клонирование и генетическая характеристика региона, содержащего ген болезни Вильсона». Природная генетика . 5 (4): 338–43. дои : 10.1038/ng1293–338 . ПМИД   8298640 . S2CID   12997875 .
  18. ^ Олсон, М.В. (15 мая 1993 г.). «Проект генома человека» . Труды Национальной академии наук . 90 (10): 4338–4344. Бибкод : 1993PNAS...90.4338O . дои : 10.1073/pnas.90.10.4338 . eISSN   1091-6490 . ISSN   0027-8424 . ПМК   46506 . ПМИД   8506271 .
  19. ^ Халди М., Перро В., Сомье М., Десаи Т., Коэн Д., Шериф Д., Уорд Д., Ландер Э.С. (декабрь 1994 г.). «Крупные человеческие YAC, сконструированные в штамме rad52, демонстрируют пониженный уровень химеризма» . Геномика . 24 (3): 478–84. дои : 10.1006/geno.1994.1656 . ПМИД   7713499 .
  20. ^ Бронсон С.К., Пей Дж., Тайлон-Миллер П., Чорни М.Дж., Джерати Д.Е., Чаплин Д.Д. (март 1991 г.). «Выделение и характеристика клонов искусственных хромосом дрожжей, связывающих локусы HLA-B и HLA-C» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 88 (5): 1676–80. Бибкод : 1991PNAS...88.1676B . дои : 10.1073/pnas.88.5.1676 . ПМК   51087 . ПМИД   2000377 .
  21. ^ Jump up to: а б Роуэн Л., Махайрас Г. и Худ Л. Секвенирование генома человека. Наука (1997).
  22. ^ Макферсон Дж.Д., Марра М., Хиллиер Л., Уотерстон Р.Х., Чинвалла А., Уоллис Дж. и др. (февраль 2001 г.). «Физическая карта генома человека» . Природа . 409 (6822): 934–41. Бибкод : 2001Natur.409..934M . дои : 10.1038/35057157 . ПМИД   11237014 .
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Yeast_artificial_chromosome&oldid=1215942319"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: 6a1fb100d990e6b767f77f7eccfdd266__1711581000
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/6a/66/6a1fb100d990e6b767f77f7eccfdd266.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Yeast artificial chromosome - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)