Фосмиды
Фосмиды похожи на космиды , но основаны на бактериальной F-плазмиде . Вектор клонирования ограничен, поскольку хозяин (обычно E. coli ) может содержать только одну молекулу фосфориды. Фосмиды могут содержать вставки ДНК размером до 40 т.п.н.; часто источником вставки является случайная геномная ДНК. Библиотеку фосмид готовят путем извлечения геномной ДНК из целевого организма и клонирования ее в фосмидный вектор. [1] Затем смесь для лигирования упаковывают в фаговые частицы, и ДНК трансфицируют в бактериального хозяина. Бактериальные клоны размножают фосмидную библиотеку. Низкое число копий обеспечивает более высокую стабильность, чем векторы с относительно более высоким числом копий, включая космиды. Фосмиды могут быть полезны для создания стабильных библиотек из сложных геномов . Фосмиды обладают высокой структурной стабильностью и, как было обнаружено, эффективно поддерживают ДНК человека даже после 100 поколений роста бактерий. [2] Фосмидные клоны использовались для оценки точности общедоступной последовательности генома человека. [3]
Открытие
[ редактировать ]Плазмида фертильности или F-плазмида была открыта Эстер Ледерберг и кодирует информацию для биосинтеза половых пилусов, способствующую бактериальной конъюгации. Конъюгация включает использование половых пилусов для образования моста между двумя бактериальными клетками; этот мост позволяет F+-клетке переносить одноцепочечную копию плазмиды, так что обе клетки содержат копию плазмиды. По пути в клетку-реципиент соответствующая цепь ДНК синтезируется реципиентом. Донорская клетка сохраняет функциональную копию плазмиды. Позже было обнаружено, что фактор F был первым эписомой и может существовать как независимая плазмида, что делает его очень стабильным вектором для клонирования. Конъюгация способствует формированию библиотек бактериальных клонов, гарантируя, что все клетки содержат желаемую фосмиду. [4]
Фосмиды представляют собой векторы ДНК, которые используют механизмы начала репликации и разделения F-плазмиды, что позволяет клонировать большие фрагменты ДНК. Легко подготовить библиотеку, обеспечивающую 20–70-кратное избыточное покрытие генома. [5]
Библиотеки ДНК
[ редактировать ]Первым шагом в секвенировании целых геномов является клонирование генома в управляемые единицы длиной около 50-200 килобаз. Идеально использовать библиотеку фосмид из-за ее стабильности и ограничения одной плазмиды на клетку. Ограничивая количество плазмид в клетках, снижается потенциал рекомбинации, что позволяет сохранить вставку генома. [6]
Фосмиды содержат несколько функциональных элементов:
- OriT (Происхождение переноса): последовательность, которая отмечает отправную точку конъюгативного переноса.
- OriV (начало репликации): последовательность, начиная с которой плазмидная ДНК будет реплицироваться в клетке-реципиенте.
- tra-регион (гены-переносчики): гены, кодирующие процесс переноса F-Pilus и ДНК.
- IS (Элементы вставки): так называемые «эгоистичные гены» (фрагменты последовательностей, которые могут интегрировать свои копии в разных местах).
Совершенствуются методы разрезания и встраивания ДНК в фосмидные векторы. Сейчас существует множество компаний, которые могут создать библиотеку фосформид из любого образца ДНК за очень короткий период времени и при относительно низких затратах. Это имело жизненно важное значение, поскольку позволило исследователям секвенировать многочисленные геномы для изучения. С помощью различных методов было полностью секвенировано более 6651 генома организмов, из которых 58 695 продолжаются. [7]
Использование
[ редактировать ]Иногда трудно точно отличить отдельные хромосомы по длине хромосом, соотношению плеч и характеру C-бэндинга. Фосмиды можно использовать в качестве надежных цитологических маркеров для идентификации отдельных хромосом, а кариотипы метафазных хромосом на основе флуоресцентной гибридизации in situ можно использовать, чтобы показать, были ли успешно сконструированы положения этих фосмид. [8]
Фосмидная система отлично подходит для быстрого создания хромосомно-специфичных мини-BAC-библиотек из проточной сортировки хромосомной ДНК. Основное преимущество фосмид перед другими космидными системами заключается в их способности стабильно размножать фрагменты ДНК человека. [9] ДНК человека, обладающая высокой повторяемостью по своей природе, хорошо известна своей крайней нестабильностью в многокопийных векторных системах. Было обнаружено, что стабильность резко возрастает, когда вставки ДНК человека присутствуют в единичных копиях в клетках E. coli с дефицитом рекомбинации . Таким образом, фосмиды служат надежными субстратами для крупномасштабного секвенирования геномной ДНК. [2]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Холл Б.Г. (май 2004 г.). «Прогнозирование эволюции генов устойчивости к антибиотикам». Обзоры природы. Микробиология . 2 (5): 430–5. дои : 10.1038/nrmicro888 . ПМИД 15100696 . S2CID 8892046 .
- ^ Jump up to: а б Шизуя Х., Биррен Б., Ким У.Дж., Манчино В., Слепак Т., Тачиири Ю., Саймон М. (сентябрь 1992 г.). «Клонирование и стабильное поддержание фрагментов ДНК человека длиной 300 тысяч оснований в Escherichia coli с использованием вектора на основе F-фактора» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 89 (18): 8794–7. Бибкод : 1992PNAS...89.8794S . дои : 10.1073/pnas.89.18.8794 . ПМК 50007 . ПМИД 1528894 .
- ^ Ким У.Дж., Шизуя Х., де Йонг П.Дж., Биррен Б., Саймон М.И. (март 1992 г.). «Стабильное размножение вставок человеческой ДНК размером с космиду в векторе на основе F-фактора» . Исследования нуклеиновых кислот . 20 (5): 1083–5. дои : 10.1093/нар/20.5.1083 . ПМК 312094 . ПМИД 1549470 .
- ^ Бауман, Роберт. Микробиология болезней по систематике (3-е изд.). Пирсон Образовательная Пресса. п. 218.
- ^ \ Ким У.Дж., Шизуя Х., Сайнс Дж., Гарнес Дж., Пульст С.М., де Йонг П., Саймон М.И. (октябрь 1995 г.). «Создание и использование библиотеки фосмид, специфичной для 22 хромосомы человека». Генетический анализ: биомолекулярная инженерия . 12 (2): 81–4. дои : 10.1016/1050-3862(95)00122-0 . ПМИД 8574898 .
- ^ Гибсон, Грег. Муза, Спенсер. «Букварь по геномной науке». Третье издание. Синауэр Ассошиэйтс стр.84-85
- ^ «JGI GOLD — Дом» . gold.jgi-psf.org . Архивировано из оригинала 16 апреля 2021 г. Проверено 17 апреля 2015 г.
- ^ Лю, К. 2010 Кариотипирование дыни (Cucumis melo L.) с помощью межвидовой фосмидной флуоресценции, гибридизация in situ, ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ГЕНОМНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
- ^ Турсун Б., Кочелла Л., Каррера И., Хоберт О. (2009). «Набор инструментов и надежный конвейер для создания репортерных генов на основе фосмид у C. elegans» . ПЛОС ОДИН . 4 (3): е4625. Бибкод : 2009PLoSO...4.4625T . дои : 10.1371/journal.pone.0004625 . ПМК 2649505 . ПМИД 19259264 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]Виды нуклеиновых кислот |
|---|
