Хромотест
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( март 2012 г. ) |
Для фармакологии и генетики используется тест Umu Chromotest , впервые разработанный и опубликованный Oda et al., [ 1 ] биологический анализ ( биоанализ ) для оценки генотоксического потенциала химических соединений . Он основан на способности агентов, повреждающих ДНК, индуцировать экспрессию оперона umu . Что касается индуцируемых повреждением (din) генов RecA, lexA и umuD, ген umuC по существу участвует в бактериальном мутагенезе посредством SOS-ответа .
В этом тесте используется слияние оперонов, в котором оперон lac (отвечающий за выработку β-галактозидазы, белка, расщепляющего лактозу) находится под контролем белков, связанных с umu. Простой колориметрический тест возможен путем добавления аналога лактозы, который разлагается β-галактозидазой, с образованием окрашенного соединения, которое можно количественно измерить с помощью спектрофотометрии . Степень развития цвета является косвенным показателем вырабатываемой β-галактозидазы, которая сама по себе напрямую связана с количеством повреждений ДНК.
Дополнительным преимуществом Umu Chromotest является то, что его процедура кодифицирована в соответствии со стандартом ISO 13829 «Качество воды. Определение генотоксичности воды и сточных вод с использованием UMU-теста». Хотя генотоксичность не может быть напрямую связана с развитием рака у людей, сильная корреляция между генотоксическим действием бактерий и их мутагенными и вызывающими опухоли свойствами у млекопитающих. было показано, что существует [ 2 ] [ 3 ]
Теория
[ редактировать ]Бактерии Salmonella typhimurium TA 1535 [pSK 1002] подвергаются воздействию потенциально генотоксичных тестируемых соединений в 96-луночном микропланшете. Если в бактериальном геноме возникают генотоксические поражения, ген umuC индуцируется как часть общего SOS-ответа . Плазмида pSK1002 содержит ген umuC, слитый с репортерным геном lacZ, во многом аналогично слиянию в SOS Chromotest. Таким образом, индукция гена umuC является мерой генотоксического потенциала образца. Поскольку ген umuC слит с lacZ-геном β-галактозидазы, индукцию гена umuC можно легко оценить путем определения активности β-галактозидазы, измеряемой по превращению бесцветного субстрата ONPG (о-нитрофенил -β-D-галактопиранозид) до желтого продукта о-нитрофенила под действием lacZ-кодируемой B-галактозидазы. [ 4 ]
Поскольку SOS-ответ представляет собой общий ответ на генотоксические поражения, одного штамма S. typhimurium с соответствующей конструкцией репортерного гена достаточно для идентификации всех классов бактериальных генотоксинов. Как и в случае других анализов бактериальной генотоксичности и мутагенности, соединения, активность которых требует метаболической активации, можно исследовать с добавлением микросомального экстракта печени крысы S9.
Процедура
[ редактировать ]Бактерии S. typhimurium в экспоненциальной фазе роста подвергаются в течение 2 часов воздействию уменьшающихся концентраций тестируемого образца в трех экземплярах, включая положительный и отрицательный контроль, а также холостые образцы. Через 2 часа экспонированные культуры разбавляют свежей питательной средой и оставляют расти еще на 2 часа. Индукцию гена umuC и слитого репортерного гена lacZ и последующую экспрессию β-галактозидазы оценивают после лизиса бактерий. Бесцветный ONPG превращается в желтый продукт о-нитрофенил в присутствии индуцированной β-галактозидазы. Интенсивность цвета коррелирует с количеством индуцированного белка и, следовательно, с генотоксической активностью тестируемого образца.
Используются количественные показатели: оптическая плотность планшета измеряется при OD600 до и после фазы роста, а также при OD420 после инкубации ONPG. Это позволяет рассчитать коэффициент индукции (IR), а также фактор роста, чтобы определить, присутствует ли цитотоксичность, и сделать значения IR недействительными. [ 5 ]
Преимущества
[ редактировать ]Высокая корреляция между Хромотестом Уму и традиционным тестом Эймса на мутагенность делает его разумной альтернативой для раннего тестирования тысяч новых фармацевтических, сельскохозяйственных и промышленных химикатов, синтезируемых каждый год. Большинство крупных производителей химической продукции имеют возможность проверять 100 или более синтетических химикатов в год с помощью традиционного теста Эймса, который требует использования нескольких штаммов сальмонелл. Тест UMU, в котором используется только один штамм сальмонеллы, потенциально может протестировать более широкий спектр новых химических веществ с теми же ресурсами. Сокращение материальных и трудовых затрат, а также надежность также делают его подходящим фильтром для сложных проб окружающей среды. [ 6 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ясунага, Киёнари, Оикава, Абэ, Ёсикава (1985). «Оценка новой системы (уму-тест) для обнаружения мутагенов и канцерогенов окружающей среды». Мутационные исследования . 147 (5): 219–229. дои : 10.1016/0165-1161(85)90062-7 . ПМИД 3900709 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Мон (1981). «Бактериальные системы для тестирования канцерогенности». Мутационные исследования . 87 (2): 191–210. дои : 10.1016/0165-1110(81)90032-4 . ПМИД 6799816 .
- ^ Покупка (1982). «Оценка прогностических тестов на канцерогенность». Мутационные исследования . 99 (1): 53–71. дои : 10.1016/0165-1110(82)90031-8 . ПМИД 6811893 .
- ^ Райффершайд, Хайль, Ода, Зан (1991). «Микропланшетная версия SOS/umu-теста для быстрого обнаружения генотоксинов и генотоксического потенциала образцов окружающей среды». Мутационные исследования . 253 (3): 215–222. дои : 10.1016/0165-1161(91)90134-Т . ПМИД 1720196 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ ISO 13829 «Качество воды. Определение генототоксичности воды и сточных вод с использованием уму-теста» .
- ^ Ясунага, Киёнари, Оикава, Абэ, Ёсикава (2004). «Оценка теста Salmonella umu с 83 химическими веществами NTP». Энвайрон Мол Мутаген . 44 (4): 329–45. дои : 10.1002/em.20053 . ПМИД 15476194 . S2CID 7419454 .
{{cite journal}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )