CRISPR-ассоциированные транспозоны
CRISPR-ассоциированные транспозоны или CAST — это мобильные генетические элементы ( MGE ), которые эволюционировали, чтобы использовать минимальные системы CRISPR для транспозиции своей ДНК под управлением РНК. [ 1 ] В отличие от традиционных систем CRISPR , которые содержат механизмы интерференции для разрушения целевой ДНК, в CAST отсутствуют белки и/или белковые домены, ответственные за расщепление ДНК. [ 2 ] Специализированный транспозонный механизм, аналогичный механизму хорошо изученного транспозона Tn7 , образует комплексы с РНК CRISPR (crRNA) и связанными с ним белками Cas для транспозиции. [ 1 ] Системы CAST были охарактеризованы для широкого спектра бактерий и используют различные конфигурации CRISPR, включая тип IF, тип IB, тип IC, тип ID, тип IE, тип IV и тип VK. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] MGE остаются важной частью генетического обмена посредством горизонтального переноса генов, а CAST участвуют в обмене механизмами устойчивости к антибиотикам и противовирусной защите, а также генами, участвующими в центральном углеродном метаболизме. [ 5 ] [ 6 ] Эти системы перспективны для генной инженерии благодаря их программируемости, гибкости PAM и способности вставляться непосредственно в геном хозяина без разрывов двойной цепи, требующих активации механизмов репарации хозяина. [ 3 ] [ 7 ] У них также отсутствуют белки Cas1 и Cas2, и поэтому они полагаются на другие, более полные системы CRISPR для приобретения спейсера в транс. [ 2 ] [ 3 ]
Естественная структура и функция
[ редактировать ]CRISPR-ассоциированные транспозоны аналогичны транспозонам Tn7, который функционирует по механизму вырезания и вставки. [ 1 ] Он содержит гетеромерную транспозазу, состоящую из белков TnsA и TnsB, и белок-регулятор TnsC. [ 1 ] Структурный анализ показал связывание белка TnsB и мотивов, специфичных для последовательности, на концах транспозона, что обеспечивает вырезание и подвижность. [ 8 ] Нацеливание на интеграцию осуществляется белками TnsD или TnsE, которые преимущественно нацелены на безопасные участки внутри хромосомы хозяина или мобильные элементы (плазмиды или бактериофаги) соответственно. [ 1 ] TnsE не обнаружен в CAST, но гомолог TnsD, TniQ, присутствует и функционирует, устраняя разрыв между транспозазой и CRISPR-Cas. [ 9 ] Было обнаружено, что несколько типов CRISPR связаны с транспозонами, причем два из наиболее изученных — это тип IF, в котором используется эффектор из нескольких субъединиц (каскад), и тип VK, в котором используется один эффектор Cas12k. [ 3 ] [ 7 ] В обоих случаях транспозоны Tn7 эволюционировали, чтобы использовать эти эффекторы для создания R-петлей для сайт-специфической интеграции. [ 3 ] Хотя TnsA присутствует в системах типа IF, он отсутствует в системах типа VK, которые показали более высокую степень нецелевой интеграции во время первоначальной характеристики. [ 3 ] [ 10 ]
Тип ИФ-3
[ редактировать ]CAST типа IF-3 (Tn6677) первоначально был идентифицирован у Vibrio Cholerae и подвергся тщательному изучению. [ 7 ] Эта система содержит белки TnsA, TnsB и TnsC, которые образуют комплекс с Cas6, Cas7 и слиянием Cas5-Cas8 за счет взаимодействия с TniQ. [ 9 ] Первоначальные этапы интеграции включают связывание TniQ-Cascade в целевом сайте и удаление транспозона TnsA и TnsB, за которым следует связывание TnsC с TniQ и связывание транспозазы с TnsC. [ 9 ] Перед этим последним шагом может произойти отклонение от цели, но связывание TnsB и TnsC приводит к последнему этапу корректуры для поддержания высокого процента попадания в цель. [ 11 ] Интеграция Tn6677 была подтверждена с почти 100% эффективностью воздействия на цель в определенных местах в нескольких точках генома хозяина. [ 7 ] Другие системы также были охарактеризованы и проверены в этом классе с различными диапазонами эффективности и включают ортогональные системы для мультиплексных вставок размером до 10 КБ. [ 6 ] [ 12 ]
Уникальной характеристикой систем типа IF-3 является наличие направляющей РНК, которая используется для нацеливания на хромосому хозяина. Эти системы приватизировали соответствующие спейсеры за счет использования атипичных crRNA, которые не позволяют эндогенным системам типа 1F использовать проводники и их механизмы интерференции для деградации хозяина. [ 13 ] Другим механизмом приватизации является использование допуска несоответствия, позволяющее только системам CAST нацеливаться на участки генома без точного совпадения со спейсером. [ 13 ]
Type V-K
[ редактировать ]Система типа VK была первоначально охарактеризована из цианобактерий Scytonema hofmanni и содержит единственный эффектор Cas, Cas12k, который функционирует с tracrRNA . [ 3 ] Эта система функционирует аналогично Tn7, но не содержит белка TnsA, что может привести к смещению цели и образованию химер во время сверхэкспрессии. [ 10 ] Комплекс Cas12k и tracrRNA связывается с целевым сайтом, и TnsC полимеризуется непосредственно рядом с ним перед присоединением TniQ и распознаванием и интеграцией TnsB. [ 14 ] Хотя эти системы используют традиционные tracrRNA, характерные для систем CRISPR типа II, они также могут нацеливаться на короткие crRNA, расположенные рядом с концом транспозона. [ 15 ] Спейсеры типа VK преимущественно нацелены на участки рядом с генами тРНК, но в этих коротких проводниках crРНК наблюдались и другие участки, которые были получены нетрадиционными способами. [ 15 ]
Применение в генной инженерии
[ редактировать ]CRISPR-ассоциированные транспозоны использовались для редактирования генов in vitro и in vivo на разных мишенях, у разных хозяев и с разной полезной нагрузкой. Все CAST-компоненты системы Tn6677 из Vibrio cholerae были объединены в одну плазмиду, и было подтверждено, что они доставляют транспозоны размером до 10 т.п.н. с почти 100% эффективностью. [ 16 ] Это также было показано в контексте сообщества с конъюгативной доставкой суицидальных векторов, обеспечивающей устойчивость к антибиотикам или улучшенную метаболическую функцию только у одного микроба. [ 17 ] Большая часть первоначальных характеристик этих систем была проведена на E. coli , но функциональность была подтверждена у бета- и гаммапротеобактерий с высокой эффективностью и у альфапротеобактерий с несколько меньшей эффективностью. [ 18 ] Также было показано, что одна плазмида Tn677 функционирует в клетках человека HEK293T, что указывает на потенциальное терапевтическое применение в будущем. [ 19 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Перейти обратно: а б с д и ж Петерс Ю.Э., Макарова К.С., Шмаков С., Кунин Е.В. (август 2017 г.). «Привлечение систем CRISPR-Cas с помощью Tn7-подобных транспозонов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 114 (35): Е7358–Е7366. Бибкод : 2017PNAS..114E7358P . дои : 10.1073/pnas.1709035114 . ПМЦ 5584455 . ПМИД 28811374 .
- ^ Перейти обратно: а б с Фор Г., Шмаков С.А., Ян В.С., Ченг Д.Р., Скотт Д.А., Питерс Дж.Е. и др. (август 2019 г.). «CRISPR-Cas в мобильных генетических элементах: контрзащита и не только» . Обзоры природы. Микробиология . 17 (8): 513–525. дои : 10.1038/s41579-019-0204-7 . ПМЦ 11165670 . ПМИД 31165781 . S2CID 174809341 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж г Стрекер Дж., Ладха А., Гарднер З., Шмид-Бургк Дж.Л., Макарова К.С., Кунин Е.В., Чжан Ф. (июль 2019 г.). «Вставка ДНК под контролем РНК с помощью CRISPR-ассоциированных транспозаз» . Наука . 365 (6448): 48–53. Бибкод : 2019Sci...365...48S . doi : 10.1126/science.aax9181 . ПМК 6659118 . ПМИД 31171706 .
- ^ Рыбарски-младший, Ху К., Хилл А.М., Уилке К.О., Финкельштейн И.Дж. (декабрь 2021 г.). «Метагеномное открытие CRISPR-ассоциированных транспозонов» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 118 (49). Бибкод : 2021PNAS..11812279R . дои : 10.1073/pnas.2112279118 . ПМЦ 8670466 . ПМИД 34845024 .
- ^ Бенлер С., Фор Г., Алтае-Тран Х., Шмаков С., Чжэн Ф., Кунин Э. (декабрь 2021 г.). Джованнони С.Дж. (ред.). «Грузовые гены Tn 7 -подобных транспозонов включают огромное разнообразие защитных систем, мобильных генетических элементов и генов устойчивости к антибиотикам» . мБио . 12 (6): e0293821. дои : 10.1128/mBio.02938-21 . ПМЦ 8649781 . ПМИД 34872347 .
- ^ Перейти обратно: а б Кломпе С.Е., Джабер Н., Бех Л.И., Мохабир Дж.Т., Бернхайм А., Штернберг Ш. (февраль 2022 г.). «Эволюционное и механистическое разнообразие транспозонов, связанных с CRISPR типа IF» . Молекулярная клетка . 82 (3): 616–628.e5. doi : 10.1016/j.molcel.2021.12.021 . ПМЦ 8849592 . ПМИД 35051352 .
- ^ Перейти обратно: а б с д Кломпе SE, Vo PL, Halpin-Healy TS, Sternberg SH (июль 2019 г.). «Системы CRISPR-Cas, кодируемые транспозонами, направляют интеграцию ДНК под управлением РНК». Природа . 571 (7764): 219–225. дои : 10.1038/s41586-019-1323-z . ПМИД 31189177 . S2CID 189817057 .
- ^ Качмарска З., Чарноцки-Цецюра М., Гурекка-Минаковска К.М., Винго Р.Дж., Яцкевич Дж., Зайко В. и др. (июль 2022 г.). «Структурная основа распознавания концов транспозона объясняет основные особенности систем транспозиции Tn7» . Молекулярная клетка . 82 (14): 2618–2632.e7. doi : 10.1016/j.molcel.2022.05.005 . ПМЦ 9308760 . ПМИД 35654042 .
- ^ Перейти обратно: а б с Халпин-Хили Т.С., Кломпе С.Э., Штернберг С.Х., Фернандес И.С. (январь 2020 г.). «Структурные основы нацеливания на ДНК с помощью системы CRISPR-Cas, кодируемой транспозонами». Природа . 577 (7789): 271–274. дои : 10.1038/s41586-019-1849-0 . ПМИД 31853065 . S2CID 209410376 .
- ^ Перейти обратно: а б Тоу CJ, Орр Б., Кляйнстивер Б.П. (июль 2023 г.). «Точная вставка ДНК методом вырезания и вставки с использованием сконструированных транспозаз, связанных с CRISPR типа VK». Природная биотехнология . 41 (7): 968–979. дои : 10.1038/s41587-022-01574-x . ПМИД 36593413 . S2CID 255464426 .
- ^ Хоффманн Ф.Т., Ким М., Бех Л.И., Ван Дж., Во П.Л., Гелсингер Д.Р. и др. (сентябрь 2022 г.). «Селективное привлечение TnsC повышает точность транспозиции под контролем РНК» . Природа . 609 (7926): 384–393. Бибкод : 2022Natur.609..384H . дои : 10.1038/s41586-022-05059-4 . ПМЦ 10583602 . ПМИД 36002573 .
- ^ Робертс А., Нетери М.А., Баррангу Р. (ноябрь 2022 г.). «Функциональная характеристика транспозонов различных типов, связанных с IF CRISPR» . Исследования нуклеиновых кислот . 50 (20): 11670–11681. дои : 10.1093/nar/gkac985 . ПМЦ 9723613 . ПМИД 36384163 .
- ^ Перейти обратно: а б Петасси М.Т., Се С.К., Петерс Дж.Э. (декабрь 2020 г.). «Категоризация направляющих РНК позволяет выбирать целевой сайт в транспозонах Tn7-CRISPR-Cas» . Клетка . 183 (7): 1757–1771.e18. дои : 10.1016/j.cell.2020.11.005 . ПМК 7770071 . ПМИД 33271061 .
- ^ Керкес И, Шмитц М, Оберли С, Чанес С, Джинек М (ноябрь 2021 г.). «Выбор и ремоделирование целевого сайта с помощью систем CRISPR-транспозонов типа V» . Природа . 599 (7885): 497–502. Бибкод : 2021Natur.599..497Q . дои : 10.1038/s41586-021-04030-z . ПМЦ 7613401 . ПМИД 34759315 .
- ^ Перейти обратно: а б Сайто М., Ладха А., Стрекер Дж., Фор Г., Нейман Э., Алтае-Тран Х. и др. (апрель 2021 г.). «Двойные режимы хоминга транспозонов, связанных с CRISPR» . Клетка . 184 (9): 2441–2453.e18. дои : 10.1016/j.cell.2021.03.006 . ПМЦ 8276595 . ПМИД 33770501 .
- ^ Во ПЛ, Ронда С., Кломпе С.Э., Чен Э.Э., Акри С., Ван Х.Х., Штернберг С.Х. (апрель 2021 г.). «CRISPR-РНК-ориентированные интегразы для высокоэффективной мультиплексной инженерии бактериального генома» . Природная биотехнология . 39 (4): 480–489. дои : 10.1038/s41587-020-00745-y . ПМЦ 10583764 . ПМИД 33230293 .
- ^ Рубин Б.Е., Даймонд С., Кресс Б.Ф., Критс-Кристоф А., Лу Ю.К., Борхес А.Л. и др. (январь 2022 г.). «Видовое и сайт-специфическое редактирование генома в сложных бактериальных сообществах» . Природная микробиология . 7 (1): 34–47. дои : 10.1038/s41564-021-01014-7 . ПМК 9261505 . ПМИД 34873292 .
- ^ Трухильо Родригес Л., Эллингтон Эй.Дж., Райш Ч.Р., Шевретт М.Г. (июль 2023 г.). «CRISPR-ассоциированная транспозаза для направленного мутагенеза у разнообразных протеобактерий» . ACS Синтетическая биология . 12 (7): 1989–2003. doi : 10.1021/acsynbio.3c00065 . ПМЦ 10367135 . ПМИД 37368499 .
- ^ Лампе Г.Д., Кинг Р.Т., Халпин-Хили Т.С., Кломпе С.Е., Хоган М.И., Во П.Л. и др. (март 2023 г.). «Направленная интеграция ДНК в клетки человека без двухцепочечных разрывов с использованием CRISPR-ассоциированных транспозаз». Природная биотехнология . 42 (1): 87–98. дои : 10.1038/s41587-023-01748-1 . ПМЦ 10620015. ПМИД 36991112 .