Периодическая противоточная хроматография

Периодическая противоточная хроматография ( ПХХ ) — это метод проведения аффинной хроматографии в квазинепрерывном режиме. Сегодня этот процесс в основном используется для очистки антител в биофармацевтической промышленности. ^[1] а также в исследованиях и разработках. При очистке антител белок А используется в качестве аффинной матрицы. Однако периодические противоточные процессы можно применять к любой хроматографии аффинного типа. ^[2]

Основной принцип

В традиционной аффинной хроматографии одна хроматографическая колонка загружается исходным материалом до момента, когда целевой материал (продукт) больше не может удерживаться аффинным материалом.Затем смолу с адсорбированным на ней продуктом промывают от примесей. Наконец, чистый продукт элюируют другим буфером. Примечательно, что если в колонну загружено слишком много исходного материала, продукт может прорваться и, как следствие, будет потерян. Поэтому очень важно загружать колонку только частично, чтобы максимизировать выход.

Периодическая противоточная хроматография решает эту проблему, используя более одной колонки. Процессы PCC можно запускать с любым количеством столбцов, начиная с двух. ^[3] В следующем параграфе будет описана версия PCC с двумя столбцами, но другие протоколы с большим количеством столбцов основаны на тех же принципах (см. ниже).Схема, изображающая отдельные этапы процесса, показана справа. На этапе 1, так называемой фазе последовательной загрузки, столбцы 1 и 2 соединяются между собой. Колонка 1 полностью загружена образцом (красный), в то время как его прорыв фиксируется в колонке 2. На этапе 2 колонка 1 промывается, элюируется, очищается и повторно уравновешивается, в то время как загрузка отдельно продолжается на колонке 2. На этапе 3 после регенерации Наконец, на этапе 4 колонку 2 промывают, элюируют, очищают и повторно уравновешивают, в то время как загрузка продолжается независимо от колонки 1. Этот циклический процесс повторяется непрерывно.

Существует несколько вариантов периодической противоточной хроматографии с более чем двумя колонками. В этих случаях дополнительные колонки либо помещаются в поток сырья во время загрузки, что имеет тот же эффект, что и использование более длинных колонок. Альтернативно, дополнительные колонны могут оставаться в незанятом режиме ожидания во время загрузки. Этот режим обеспечивает дополнительную гарантию того, что на основной процесс не влияют протоколы стирки и очистки, хотя на практике это требуется редко. С другой стороны, недостаточно используемые колонны снижают теоретическую максимальную производительность таких процессов. Как правило, преимущества и недостатки различных многоколоночных протоколов являются предметом дискуссий. ^[4] Однако, без сомнения, по сравнению с периодическими процессами с одной колонкой, периодические противоточные процессы обеспечивают значительно повышенную производительность.

Динамическое управление процессом

Во временном масштабе непрерывной хроматографии довольно часто можно наблюдать изменения важных параметров процесса, таких как состояние колонки, качество буфера, титр (концентрация) или состав сырья. Такие изменения приводят к изменению максимальной производительности колонны относительно количества загруженного исходного материала. Поэтому для достижения стабильного качества и выхода продукции для каждого технологического цикла необходимо корректировать время отдельных этапов процесса. Ручные изменения в принципе возможны, но непрактичны. Чаще всего алгоритмы динамического управления процессом контролируют параметры процесса и автоматически применяют изменения по мере необходимости.

Сегодня используются два различных режима работы динамических контроллеров процессов (см. рисунок справа).Первый, называемый DeltaUV, отслеживает разницу между двумя сигналами детекторов, расположенных до и после первой колонки. Во время начальной загрузки существует большая разница между двумя сигналами, но она уменьшается по мере того, как примеси проходят через колонку. Как только колонка полностью насыщается примесями и задерживается только дополнительный продукт, разница между сигналами достигает постоянного значения. Пока продукт полностью захватывается колонкой, разница между сигналами будет оставаться постоянной. Как только часть продукта пробивается через колонну (ср. выше), разница уменьшается. Таким образом, можно определить сроки и объем прорыва продукта.Вторая возможность, названная AutomAb, требует только сигнала одного детектора, расположенного за первой колонкой. Во время начальной загрузки сигнал увеличивается по мере того, как через колонку проходит все больше и больше примесей. Когда колонка насыщена примесями и пока продукт полностью улавливается колонкой, сигнал остается постоянным. Как только часть продукта прорывается через колонну (ср. выше), сигнал снова возрастает. Таким образом, снова можно определить время и объем прорыва продукта.

Обе итерации теоретически работают одинаково хорошо. На практике требование наличия двух синхронизированных сигналов и воздействия на один детектор неочищенного исходного материала делает подход DetaUV менее надежным, чем AutomAb.

Коммерческая ситуация

По состоянию на 2017 год GE Healthcare владеет патентами на трехколоночную периодическую противоточную хроматографию: эта технология используется в их приборе Äkta PCC. ^{[ нужна ссылка ]} Аналогичным образом, ChromaCon имеет патенты на оптимизированную версию с двумя колонками (CaptureSMB). ^{[ нужна ссылка ]} CaptureSMB используется в ChromaCon Contichrom CUBE от и по лицензии в системах Ecoprime Twin от YMC. Дополнительные производители систем, способных проводить периодическую противоточную хроматографию, включают Novasep и Pall . ^{[ нужна ссылка ]}

Ссылки

^ Варику, Вина; Годават, Рахул; Брауэр, Кевин; Джайн, Суджит; Каммингс, Дэниел; Саймонс, Элизабет; Джонсон, Тимоти; Вальтер, Джейсон; Ю, Марселла; Райт, Бенджамин; Макларти, Джин; Кэри, Кеннет П.; Хван, Крис; Чжоу, Вэйчан; Риске, Фрэнк; Константинов, Константин (декабрь 2012 г.). «Комплексное непрерывное производство рекомбинантных терапевтических белков». Биотехнология и биоинженерия . 109 (12): 3018–3029. дои : 10.1002/бит.24584 . ПМИД 22729761 . S2CID 20663834 .
^ Годават, Рахул; Брауэр, Кевин; Джайн, Суджит; Константинов, Константин; Риске, Фрэнк; Варику, Вина (декабрь 2012 г.). «Периодическая противоточная хроматография - аспекты проектирования и эксплуатации комплексной и непрерывной очистки белков». Биотехнологический журнал . 7 (12): 1496–1508. дои : 10.1002/biot.201200068 . ПМИД 23070975 .
^ Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Баур, Дэниел; Ливроу, Роэль; Лиссенс, Герт; Морбиделли, Массимо (апрель 2015 г.). «Двухколоночный CaptureSMB: новый циклический процесс аффинной хроматографии с белком А». Журнал хроматографии А. 1389 : 85–95. дои : 10.1016/j.chroma.2015.02.046 . ПМИД 25748537 .
^ Баур, Дэниел; Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Штайнебах, Фабиан; Морбиделли, Массимо (июль 2016 г.). «Сравнение периодического и непрерывного многоколоночного захвата белка А с использованием оптимальной конструкции». Биотехнологический журнал . 11 (7): 920–931. дои : 10.1002/biot.201500481 . hdl : 11311/1013726 . ПМИД 26992151 . S2CID 205492204 .

[1] Варику, Вина; Годават, Рахул; Брауэр, Кевин; Джайн, Суджит; Каммингс, Дэниел; Саймонс, Элизабет; Джонсон, Тимоти; Вальтер, Джейсон; Ю, Марселла; Райт, Бенджамин; Макларти, Джин; Кэри, Кеннет П.; Хван, Крис; Чжоу, Вэйчан; Риске, Фрэнк; Константинов, Константин (декабрь 2012 г.). «Комплексное непрерывное производство рекомбинантных терапевтических белков». Биотехнология и биоинженерия . 109 (12): 3018–3029. дои : 10.1002/бит.24584 . ПМИД 22729761 . S2CID 20663834 .

[2] Годават, Рахул; Брауэр, Кевин; Джайн, Суджит; Константинов, Константин; Риске, Фрэнк; Варику, Вина (декабрь 2012 г.). «Периодическая противоточная хроматография - аспекты проектирования и эксплуатации комплексной и непрерывной очистки белков». Биотехнологический журнал . 7 (12): 1496–1508. дои : 10.1002/biot.201200068 . ПМИД 23070975 .

[3] Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Баур, Дэниел; Ливроу, Роэль; Лиссенс, Герт; Морбиделли, Массимо (апрель 2015 г.). «Двухколоночный CaptureSMB: новый циклический процесс аффинной хроматографии с белком А». Журнал хроматографии А. 1389 : 85–95. дои : 10.1016/j.chroma.2015.02.046 . ПМИД 25748537 .

[4] Баур, Дэниел; Ангарита, Моника; Мюллер-Шпет, Томас; Штайнебах, Фабиан; Морбиделли, Массимо (июль 2016 г.). «Сравнение периодического и непрерывного многоколоночного захвата белка А с использованием оптимальной конструкции». Биотехнологический журнал . 11 (7): 920–931. дои : 10.1002/biot.201500481 . hdl : 11311/1013726 . ПМИД 26992151 . S2CID 205492204 .

[1]

[2]

[3]

[4]