Анализ связывания фильтра

В биохимии или химии — анализ связывания фильтров это простой способ быстро изучить множество образцов. Один из способов узнать о взаимодействии между двумя молекулами — определить константу связывания , которая представляет собой число, описывающее соотношение несвязанных и связанных молекул. Эта информация показывает сродство между двумя молекулами и позволяет прогнозировать связанное количество с учетом любого набора начальных условий.

Чтобы измерить константу связывания, необходимо найти способ измерения количества образовавшегося комплекса в диапазоне начальных концентраций. Этого можно добиться, «пометив» один из видов флуоресцентной или, в данном случае, радиоактивной меткой. ДНК «маркируется» добавлением радиоактивного фосфата, полученного из аденозинтрифосфата .

Описание

Анализ связывания фильтра измеряет сродство между двумя молекулами (часто белком и ДНК) с использованием фильтра . Фильтр изготовлен из нитроцеллюлозной бумаги, которая заряжена отрицательно. Поскольку большинство белков имеют суммарный положительный заряд, нитроцеллюлозная бумага идеально подходит для иммобилизации белков. ДНК заряжена отрицательно из-за фосфатного остова и сама по себе не «прилипает» к нитроцеллюлозе, однако любая ДНК, связанная белком, будет прилипать. Точное количество ДНК, «прилипшей» к нитроцеллюлозе, определяют количественно путем измерения количества радиоактивности на фильтре с помощью сцинтилляционного счетчика .

Белок и ДНК смешивают в серии микроцентрифужных пробирок, в которых количество ДНК остается постоянным, но количество белка постепенно увеличивается. Этим образцам позволяют прийти в равновесие. После уравновешивания равный объем из каждой трубки распыляется на маленькие круглые нитроцеллюлозные фильтры, которые расположены на вакуумной пластине (плоская поверхность, к которой снизу прикладывается вакуум для всасывания жидкости вниз). зарегистрируется только тот белок, который связал ДНК Весь белок прилипнет, но сцинтилляционным счетчиком .

Теперь у вас будет число, которое описывает количество связанной ДНК для каждой концентрации используемого белка. Эту информацию можно нанести на кривую связывания, чтобы определить константу связывания .

Этот анализ больше не используется широко, но он быстрый и простой и может дать много информации. Его можно будет использовать, например, для относительно детального анализа взаимодействия конкретного белка с ДНК.

Измерьте константу равновесия:

• Инкубируйте меченую ДНК с белком.
• Дайте достаточно времени, чтобы система достигла равновесия.
• Фильтруют смесь через фильтрующий диск из нитроцеллюлозы. Белки связываются с нитроцеллюлозой, а ДНК — нет.
• Любая ДНК, оставшаяся на фильтре, остается там, потому что она взаимодействует с белком.
• Высушите фильтры и посчитайте.

Измерьте коэффициент отклонения:

• Возьмите фильтр с привязанным к нему ДНК-белковым комплексом.
• Промойте фильтр буфером.
• Определите количество ДНК, оставшееся на фильтре после его промывки в течение определенного времени.

Другой способ измерения скидки:

• Радиоактивно меченую ДНК и белок предварительно инкубировали вместе в высоких концентрациях.
• В момент времени 0 смесь была разбавлена
• Аликвоты анализировали в разное время с использованием нитроцеллюлозных фильтров.