Профилирование конечной последовательности

Профилирование конечных последовательностей (ESP) (иногда «Картирование парных концов (PEM)») — это метод, основанный на коннекторах с метками последовательностей, разработанный для облегчения секвенирования генома de novo для выявления количества копий с высоким разрешением и структурных аберраций, таких как инверсии и транслокации. .

Коротко говоря, целевую геномную ДНК выделяют и частично расщепляют ферментами рестрикции на большие фрагменты. После фракционирования по размеру фрагменты клонируют в плазмиды для создания искусственных хромосом, таких как бактериальные искусственные хромосомы (BAC), которые затем секвенируют и сравнивают с эталонным геномом. Различия, включая вариации ориентации и длины между сконструированными хромосомами и эталонным геномом, предполагают количество копий и структурные аберрации.

Создание искусственной хромосомы

Прежде чем анализировать структурные аберрации целевого генома и вариацию числа копий (CNV) с помощью ESP, целевой геном обычно амплифицируют и консервируют с помощью искусственной конструкции хромосом. Классической стратегией создания искусственной хромосомы является бактериальная искусственная хромосома (BAC). По сути, целевая хромосома случайным образом переваривается и вставляется в плазмиды, которые трансформируются и клонируются в бактериях. ^{[ 1 ]} Размер вставляемых фрагментов составляет 150–350 кб. ^{[ 2 ]} Другая часто используемая искусственная хромосома — фосмида. Разница между BAC и фосмидами заключается в размере вставленной ДНК. Фосмиды могут содержать только фрагменты ДНК длиной 40 т.п.н. ^{[ 3 ]} что позволяет более точно определить точку останова.

Обнаружение структурных аберраций

Профилирование концевых последовательностей (ESP) можно использовать для обнаружения структурных изменений, таких как инсерции, делеции и хромосомные перестройки. По сравнению с другими методами, изучающими хромосомные аномалии, ESP особенно полезен для выявления копийно-нейтральных аномалий, таких как инверсии и транслокации, которые не были бы очевидны при рассмотрении вариаций числа копий. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Из библиотеки BAC оба конца вставленных фрагментов секвенируются с использованием платформы секвенирования. Обнаружение вариаций затем достигается путем сопоставления секвенированных считываний с эталонным геномом.

Инверсия и транслокация

Инверсии и транслокации относительно легко обнаружить по неправильной паре секвенированных концов. Например, транслокацию можно обнаружить, если парные концы сопоставлены с разными хромосомами эталонного генома. ^{[ 4 ]}^{[ 5 ]} Инверсию можно обнаружить по расходящейся ориентации считываний, когда вставка будет иметь два плюсовых конца или два минусовых конца.

Хромосомные перестройки, обнаруженные с помощью ESP

Вставка и удаление

В случае вставки или делеции картирование парного конца соответствует эталонному геному. Но показания несогласны по кажущемуся размеру. Видимый размер представляет собой расстояние между концами секвенирования BAC, картированными в эталонном геноме. Если BAC имеет вставку длины (l), согласованное отображение покажет фрагмент размера (l) в эталонном геноме. Если парные концы находятся ближе, чем расстояние (l), можно подозревать вставку в образец ДНК. Расстояние (l<μ-3σ) можно использовать в качестве порогового значения для обнаружения вставки, где μ — средняя длина вставки, а σ — стандартное отклонение. ^{[ 5 ]}^{[ 6 ]} В случае делеции парные концы картируются дальше в эталонном геноме по сравнению с ожидаемым расстоянием (l> μ-3σ). ^{[ 6 ]}

Копировать вариант номера

В некоторых случаях несогласованные прочтения также могут указывать на CNV , например, при повторении последовательностей. Для более крупных CNV плотность считываний будет варьироваться в зависимости от количества копий. Увеличение количества копий будет отражено в увеличении картирования той же области эталонного генома.

История ESP

Экстрасенсорное восприятие было впервые разработано и опубликовано в 2003 году доктором Коллинзом и его коллегами из Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Их исследование выявило хромосомные перестройки и CNV раковых клеток человека MCF7 с разрешением 150 КБ, что было гораздо более точным по сравнению с CGH и спектральным кариотипированием того времени. ^{[ 5 ]} В 2007 году доктор Снайдер и его группа улучшили ESP до разрешения 3 КБ, секвенировав обе пары фрагментов ДНК размером 3 КБ без конструкции BAC. Их подход позволяет идентифицировать делеции, инверсии и вставки со средним разрешением точки разрыва 644 п.о., что близко к разрешению полимеразной цепной реакции (ПЦР). ^{[ 7 ]}

ESP-приложения

Для анализа профиля конечной последовательности можно использовать различные инструменты биоинформатики. Общие из них включают BreakDancer, PEMer, Variation Hunter, common LAW, GASV и Spanner. ^{[ 8 ]} ESP можно использовать для картирования структурных изменений с высоким разрешением в больных тканях. Этот метод в основном используется на образцах опухолей различных типов рака. Точная идентификация копийно-нейтральных хромосомных аномалий особенно важна, поскольку транслокация может привести к образованию слитых белков, химерных белков или белков с неправильной регуляцией, которые можно наблюдать в опухолях. Этот метод также можно использовать в исследованиях эволюции, выявляя большие структурные различия между различными популяциями. ^{[ 9 ]} Подобные методы разрабатываются для различных приложений. Например, для оценки микробного разнообразия путем секвенирования метки 16S V6 использовался метод парного секвенирования Illumina со штрих-кодом (BIPES). ^{[ 10 ]}

Преимущества и ограничения

Разрешение обнаружения структурных изменений с помощью ESP было увеличено до уровня, аналогичного ПЦР, и может быть дополнительно улучшено за счет выбора фрагментов ДНК более одинакового размера. ESP может применяться как со сконструированной искусственной хромосомой, так и без нее. С помощью BAC можно увековечить и сохранить драгоценные образцы, что особенно важно для небольшого количества образцов, которые планируется подвергнуть обширному анализу. Более того, BAC, несущие реаранжированные фрагменты ДНК, можно напрямую трансфицировать in vitro или in vivo для анализа функции этих структур. Однако строительство БАК по-прежнему является дорогостоящим и трудоемким. Исследователи должны быть очень осторожны при выборе стратегии, которая им нужна для конкретного проекта. Поскольку ESP рассматривает только короткие последовательности с парными концами, его преимущество заключается в предоставлении полезной информации по всему геному без необходимости крупномасштабного секвенирования. Приблизительно 100-200 опухолей можно секвенировать с разрешением более 150 КБ по сравнению с секвенированием всего генома.

Ссылки

^ О'Коннор, М; Пайфер, М ; Бендер, W (16 июня 1989 г.). «Конструирование больших сегментов ДНК в Escherichia coli». Наука . 244 (4910): 1307–12. Бибкод : 1989Sci...244.1307O . дои : 10.1126/science.2660262 . ПМИД 2660262 .
^ Стоун, штат Небраска; Фан, Дж.Б.; Уиллур, В.; Пеннаккио, Луизиана; Уоррингтон, Дж.А.; Ху, А; де ла Шапель, А; Лехесйоки, AE; Кокс, доктор медицинских наук; Майерс, Р.М. (март 1996 г.). «Построение контига бактериального клона размером 750 т.п.н. и карты рестрикции в области 21 хромосомы человека, содержащей ген прогрессирующей миоклонусной эпилепсии» . Геномные исследования . 6 (3): 218–25. дои : 10.1101/гр.6.3.218 . ПМИД 8963899 .
^ Тузун, Эрай; Шарп, Эндрю Дж; Бейли, Джеффри А; Каул, Раджиндер; Моррисон, В. Энн; Перц, Лиза М; Хауген, Эрик; Хайден, Хиллари; Альбертсон, Донна; Пинкель, Дэниел; Олсон, Мейнард В.; Эйхлер, Эван Э (15 мая 2005 г.). «Мелкомасштабные структурные вариации человеческого генома». Природная генетика . 37 (7): 727–732. дои : 10.1038/ng1562 . ПМИД 15895083 . S2CID 14162962 .
^ Jump up to: ^а ^б Башир, Али; Волик, Станислав; Коллинз, Колин; Бафна, Винет; Рафаэль, Бенджамин Дж.; Узунис, Христос А. (25 апреля 2008 г.). «Оценка стратегий секвенирования парных концов для обнаружения перестроек генома при раке» . PLOS Вычислительная биология . 4 (4): e1000051. Бибкод : 2008PLSCB...4E0051B . дои : 10.1371/journal.pcbi.1000051 . ПМЦ 2278375 . ПМИД 18404202 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Волик, С.; Чжао, С.; Чин, К.; Бребнер, Дж. Х.; Херндон, ДР; Тао, Кью; Ковбель, Д.; Хуанг, Г.; Лапук, А.; Куо, В.-Л.; Магран, Г.; де Йонг, П.; Грей, Дж.В.; Коллинз, К. (4 июня 2003 г.). «Профилирование конечных последовательностей: анализ аберрантных геномов на основе последовательностей» . Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7696–7701. Бибкод : 2003PNAS..100.7696V . дои : 10.1073/pnas.1232418100 . ПМК 164650 . ПМИД 12788976 .
^ Jump up to: ^а ^б Ян, Р; Чен, Л; Ньюман, С; Ганди, К; Дохо, Дж; Морено, CS; Вертино, премьер-министр; Берналь-Мизарки, Л; Лониал, С; Бойсе, LH; Росси, М; Ковальски, Дж; Цинь, З.С. (2014). «Комплексный анализ данных полногеномного секвенирования парных концов и парных пар для выявления структурных изменений генома при множественной миеломе» . Раковая информатика . 13 (Приложение 2): 49–53. дои : 10.4137/CIN.S13783 . ПМК 4179644 . ПМИД 25288879 .
^ Корбель, Дж.О.; Урбан, AE; Аффуртит, JP; Годвин, Б; Груберт, Ф; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев, Д; Каррьеро, Нью-Джерси; Ду, Л; Тайлон, Бельгия; Чен, З; Танцер, А; Сондерс, AC; Чи, Дж; Ян, Ф; Картер, Северная Каролина; Херлс, Мэн; Вайсман, С.М.; Харкинс, Т.Т.; Герштейн, МБ; Эгхольм, М; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Картирование парных концов обнаруживает обширные структурные различия в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–6. Бибкод : 2007Sci...318..420K . дои : 10.1126/science.1149504 . ПМЦ 2674581 . ПМИД 17901297 .
^ Чжао, Мин; Ван, Цинго; Ван, Цюань; Цзя, Пейлин; Чжао, Чжунмин (2013). «Вычислительные инструменты для обнаружения вариаций числа копий (CNV) с использованием данных секвенирования следующего поколения: особенности и перспективы» . БМК Биоинформатика . 14 (Приложение 11): S1. дои : 10.1186/1471-2105-14-S11-S1 . ПМЦ 3846878 . ПМИД 24564169 .
^ Корбель, Дж.О.; Урбан, AE; Аффуртит, JP; Годвин, Б.; Груберт, Ф.; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев Д.; Каррьеро, Нью-Джерси; Ду, Л.; Тайлон, Бельгия; Чен, З.; Танзер, А.; Сондерс, ACE; Чи, Дж.; Ян, Ф.; Картер, Северная Каролина; Херлс, Мэн; Вайсман, С.М.; Харкинс, Т.Т.; Герштейн, МБ; Эгхольм, М.; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Картирование парных концов выявляет обширные структурные различия в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–426. Бибкод : 2007Sci...318..420K . дои : 10.1126/science.1149504 . ПМЦ 2674581 . ПМИД 17901297 .
^ Чжоу, Хун-Вэй; Ли, Донг-Фан; Тэм, Нора Фунг-Йи; Цзян, Сяо-Тао; Чжан, Хай; Шэн, Хуа-Фан; Цинь, Джин; Лю, Сяо; Цзоу, Фэй (21 октября 2010 г.). «BIPES, экономичный высокопроизводительный метод оценки микробного разнообразия» . Журнал ISME . 5 (4): 741–749. дои : 10.1038/ismej.2010.160 . ПМК 3105743 . ПМИД 20962877 .

См. также

[1] О'Коннор, М; Пайфер, М ; Бендер, W (16 июня 1989 г.). «Конструирование больших сегментов ДНК в Escherichia coli». Наука . 244 (4910): 1307–12. Бибкод : 1989Sci...244.1307O . дои : 10.1126/science.2660262 . ПМИД 2660262 .

[2] Стоун, штат Небраска; Фан, Дж.Б.; Уиллур, В.; Пеннаккио, Луизиана; Уоррингтон, Дж.А.; Ху, А; де ла Шапель, А; Лехесйоки, AE; Кокс, доктор медицинских наук; Майерс, Р.М. (март 1996 г.). «Построение контига бактериального клона размером 750 т.п.н. и карты рестрикции в области 21 хромосомы человека, содержащей ген прогрессирующей миоклонусной эпилепсии» . Геномные исследования . 6 (3): 218–25. дои : 10.1101/гр.6.3.218 . ПМИД 8963899 .

[3] Тузун, Эрай; Шарп, Эндрю Дж; Бейли, Джеффри А; Каул, Раджиндер; Моррисон, В. Энн; Перц, Лиза М; Хауген, Эрик; Хайден, Хиллари; Альбертсон, Донна; Пинкель, Дэниел; Олсон, Мейнард В.; Эйхлер, Эван Э (15 мая 2005 г.). «Мелкомасштабные структурные вариации человеческого генома». Природная генетика . 37 (7): 727–732. дои : 10.1038/ng1562 . ПМИД 15895083 . S2CID 14162962 .

[plos2008-4] Jump up to: ^а ^б Башир, Али; Волик, Станислав; Коллинз, Колин; Бафна, Винет; Рафаэль, Бенджамин Дж.; Узунис, Христос А. (25 апреля 2008 г.). «Оценка стратегий секвенирования парных концов для обнаружения перестроек генома при раке» . PLOS Вычислительная биология . 4 (4): e1000051. Бибкод : 2008PLSCB...4E0051B . дои : 10.1371/journal.pcbi.1000051 . ПМЦ 2278375 . ПМИД 18404202 .

[proceedings-5] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Волик, С.; Чжао, С.; Чин, К.; Бребнер, Дж. Х.; Херндон, ДР; Тао, Кью; Ковбель, Д.; Хуанг, Г.; Лапук, А.; Куо, В.-Л.; Магран, Г.; де Йонг, П.; Грей, Дж.В.; Коллинз, К. (4 июня 2003 г.). «Профилирование конечных последовательностей: анализ аберрантных геномов на основе последовательностей» . Труды Национальной академии наук . 100 (13): 7696–7701. Бибкод : 2003PNAS..100.7696V . дои : 10.1073/pnas.1232418100 . ПМК 164650 . ПМИД 12788976 .

[yang-6] Jump up to: ^а ^б Ян, Р; Чен, Л; Ньюман, С; Ганди, К; Дохо, Дж; Морено, CS; Вертино, премьер-министр; Берналь-Мизарки, Л; Лониал, С; Бойсе, LH; Росси, М; Ковальски, Дж; Цинь, З.С. (2014). «Комплексный анализ данных полногеномного секвенирования парных концов и парных пар для выявления структурных изменений генома при множественной миеломе» . Раковая информатика . 13 (Приложение 2): 49–53. дои : 10.4137/CIN.S13783 . ПМК 4179644 . ПМИД 25288879 .

[7] Корбель, Дж.О.; Урбан, AE; Аффуртит, JP; Годвин, Б; Груберт, Ф; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев, Д; Каррьеро, Нью-Джерси; Ду, Л; Тайлон, Бельгия; Чен, З; Танцер, А; Сондерс, AC; Чи, Дж; Ян, Ф; Картер, Северная Каролина; Херлс, Мэн; Вайсман, С.М.; Харкинс, Т.Т.; Герштейн, МБ; Эгхольм, М; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Картирование парных концов обнаруживает обширные структурные различия в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–6. Бибкод : 2007Sci...318..420K . дои : 10.1126/science.1149504 . ПМЦ 2674581 . ПМИД 17901297 .

[8] Чжао, Мин; Ван, Цинго; Ван, Цюань; Цзя, Пейлин; Чжао, Чжунмин (2013). «Вычислительные инструменты для обнаружения вариаций числа копий (CNV) с использованием данных секвенирования следующего поколения: особенности и перспективы» . БМК Биоинформатика . 14 (Приложение 11): S1. дои : 10.1186/1471-2105-14-S11-S1 . ПМЦ 3846878 . ПМИД 24564169 .

[9] Корбель, Дж.О.; Урбан, AE; Аффуртит, JP; Годвин, Б.; Груберт, Ф.; Саймонс, Дж. Ф.; Ким, премьер-министр; Палеев Д.; Каррьеро, Нью-Джерси; Ду, Л.; Тайлон, Бельгия; Чен, З.; Танзер, А.; Сондерс, ACE; Чи, Дж.; Ян, Ф.; Картер, Северная Каролина; Херлс, Мэн; Вайсман, С.М.; Харкинс, Т.Т.; Герштейн, МБ; Эгхольм, М.; Снайдер, М. (19 октября 2007 г.). «Картирование парных концов выявляет обширные структурные различия в геноме человека» . Наука . 318 (5849): 420–426. Бибкод : 2007Sci...318..420K . дои : 10.1126/science.1149504 . ПМЦ 2674581 . ПМИД 17901297 .

[10] Чжоу, Хун-Вэй; Ли, Донг-Фан; Тэм, Нора Фунг-Йи; Цзян, Сяо-Тао; Чжан, Хай; Шэн, Хуа-Фан; Цинь, Джин; Лю, Сяо; Цзоу, Фэй (21 октября 2010 г.). «BIPES, экономичный высокопроизводительный метод оценки микробного разнообразия» . Журнал ISME . 5 (4): 741–749. дои : 10.1038/ismej.2010.160 . ПМК 3105743 . ПМИД 20962877 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]