SOS хромотест

SOS -хромотест — это биологический анализ для оценки генотоксического потенциала химических соединений. Тест представляет собой колориметрический анализ, который измеряет экспрессию генов, индуцированных генотоксичными агентами в Escherichia coli , посредством слияния со структурным геном β-галактозидазы . Тест проводится в течение нескольких часов в колонках 96-луночного микропланшета с возрастающими концентрациями тестируемых образцов. Этот тест был разработан как практическое дополнение или альтернатива традиционному тесту Эймса на генотоксичность , который включает выращивание бактерий на чашках с агаром и сравнение естественной скорости мутации со скоростью мутации бактерий, подвергшихся воздействию потенциально мутагенных соединений или образцов. Хромотест SOS сравним по точности и чувствительности с традиционными методами, такими как тест Эймса, и является полезным инструментом для скрининга генотоксичных соединений, которые могут оказаться канцерогенными для человека, с целью выделения химических веществ для дальнейшего углубленного анализа. ^{[ 1 ]}^{[ 2 ]}

Как и в случае с другими анализами бактериальной генотоксичности и мутагенности, соединения, активность которых требует метаболической активации, можно исследовать с добавлением микросомального экстракта печени крысы S9.

Механизм

Реакция SOS играет центральную роль в реакции E. coli на генотоксичные соединения, поскольку она реагирует на широкий спектр химических агентов. Запуск этой системы может использоваться и использовался как ранний признак повреждения ДНК. Два гена играют ключевую роль в SOS-ответе: lexA кодирует репрессор для всех генов системы, а RecA кодирует белок, способный расщеплять репрессор LexA при активации SOS-индуцирующим сигналом (вызванным в данном случае наличием генотоксичное соединение). Хотя точный механизм SOS-ответа до сих пор неизвестен, он индуцируется, когда повреждения ДНК нарушают или останавливают репликацию ДНК. . ^{[ 3 ]}

Различные конечные точки являются возможными индикаторами срабатывания системы SOS; активация белка RecA, расщепление репрессора LexA, экспрессия любого из генов SOS и т. д. Один из простейших анализов состоит в мониторинге экспрессии гена SOS посредством слияния с lacZ, структурным геном E. coli. β-галактозидаза.

Процедура

SOS-хромотест заключается в инкубации E. coli с возрастающими концентрациями тестируемого химического вещества. После предоставления времени для синтеза белка активность β-галактозидазы оценивают с помощью простого колориметрического анализа. За счет включения аналога лактозы, который при разложении дает окрашенное соединение, в качестве показателя используется легко наблюдаемое или поддающееся количественной оценке изменение цвета. Поскольку тестируемое химическое вещество может ингибировать синтез белка при более высоких концентрациях, что может привести к недооценке индукции B-галактозидазы, щелочную фосфатазу анализируют одновременно с β-галактозидазой, чтобы масштабировать данные по выживаемости клеток.

Анализ можно легко выполнить за несколько часов. При использовании устройства для считывания микропланшетов тест является количественным, а кривые «доза-эффект» имеют начальную линейную область. Наклон этой линейной области позволяет однозначно связать каждое соединение с одним параметром - SOS-индуцирующей активностью (SOSIP), которая отражает индуцирующую активность соединения. ^{[ 4 ]}

Этот анализ обеспечивает как качественное (видимое наблюдение цветового градиента) для целей скрининга, так и количественное измерение (спектрофотометрия) для расчета общепринятых показателей. В количественном анализе наносится зависимость «доза-реакция» (окрашивание, связанное с выработкой бета-галактозидазы) соединения, при этом наклон начальной линейной области используется в качестве универсального параметра, SOS-индуцирующей активности (SOSIP), который отражает способность соединения индуцировать SOS-ответ (измеряется косвенно по продукции бета-галактозидазы и расщеплению аналога лактозы). Обычно аналогом лактозы является X-Gal , который при расщеплении бета-галактозидазой дает синий цвет. Реакция на дозу также масштабируется по выживаемости клеток, измеряемой по распаду щелочной фосфатазы (которая дает желтый цвет), что позволяет рассчитать SOSIP.

Хотя SOSIP является показателем, основанным на концентрации, тот же метод можно использовать для сложных смесей окружающей среды, где концентрация или даже интересующие соединения неизвестны. Посредством расчета промежуточного коэффициента SOS-индукции (SOSIF), который можно таким же образом отобразить в зависимости от разведения, чтобы проиллюстрировать зависимость «доза-реакция» без предварительного аналитического измерения образцов.

Преимущества

Хромотест SOS считается самым простым и быстрым краткосрочным тестом на генотоксичность. Он служит полезным и экономически эффективным дополнением к традиционному тесту Эймса по ряду причин. Во-первых, благодаря своей простоте и быстроте SOS-хромотест может использоваться в качестве скринингового теста на большое количество потенциально генотоксичных соединений. Во-вторых, это может позволить обнаружить генотоксичные химические вещества, которые дают ложноотрицательные результаты теста Эймса (например, эстрадиол, соединение, вызывающее растущую озабоченность). В-третьих, это может оказаться эффективным методом выявления ложноположительных результатов теста Эймса.

Ссылки

^ Мон Г.Р. (сентябрь 1981 г.). «Бактериальные системы для тестирования канцерогенности». Мутат. Рез . 87 (2): 191–210. дои : 10.1016/0165-1110(81)90032-4 . ПМИД 6799816 .
^ Покупка IF (июль 1982 г.). «Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды. Рабочий документ ICPEMC 2/6. Оценка прогностических тестов на канцерогенность». Мутат. Рез . 99 (1): 53–71. дои : 10.1016/0165-1110(82)90031-8 . ПМИД 6811893 .
^ Кийардет, Хофнунг (1993). «SOS Chromotest: Обзор». Мутационные исследования . 297 (3): 235–279. дои : 10.1016/0165-1110(93)90019-j . ПМИД 7692273 .
^ Кийарде П., Хейсман О., Д'Ари Р., Хофнунг М. (октябрь 1982 г.). «SOS-хромотест, прямой анализ индукции SOS-функции у Escherichia coli K-12 для измерения генотоксичности» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 79 (19): 5971–5. Бибкод : 1982PNAS...79.5971Q . дои : 10.1073/pnas.79.19.5971 . ПМК 347033 . ПМИД 6821127 .

[pmid6799816-1] Мон Г.Р. (сентябрь 1981 г.). «Бактериальные системы для тестирования канцерогенности». Мутат. Рез . 87 (2): 191–210. дои : 10.1016/0165-1110(81)90032-4 . ПМИД 6799816 .

[pmid6811893-2] Покупка IF (июль 1982 г.). «Международная комиссия по защите от мутагенов и канцерогенов окружающей среды. Рабочий документ ICPEMC 2/6. Оценка прогностических тестов на канцерогенность». Мутат. Рез . 99 (1): 53–71. дои : 10.1016/0165-1110(82)90031-8 . ПМИД 6811893 .

[3] Кийардет, Хофнунг (1993). «SOS Chromotest: Обзор». Мутационные исследования . 297 (3): 235–279. дои : 10.1016/0165-1110(93)90019-j . ПМИД 7692273 .

[pmid6821127-4] Кийарде П., Хейсман О., Д'Ари Р., Хофнунг М. (октябрь 1982 г.). «SOS-хромотест, прямой анализ индукции SOS-функции у Escherichia coli K-12 для измерения генотоксичности» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 79 (19): 5971–5. Бибкод : 1982PNAS...79.5971Q . дои : 10.1073/pnas.79.19.5971 . ПМК 347033 . ПМИД 6821127 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]