ТОПО-клонирование

Клонирование на основе топоизомеразы (клонирование TOPO) — это метод молекулярной биологии , при котором ДНК фрагменты клонируются в определенные векторы без необходимости использования ДНК-лигаз . Taq-полимераза обладает независимой от матрицы терминальной трансферазной активностью, которая добавляет одиночный дезоксиаденозин (А) к 3'-концу продуктов ПЦР. Эта характеристика используется при клонировании TOPO TA с «липким концом». Для клонирования TOPO с «тупым концом» реципиентный вектор не имеет выступов, и можно клонировать фрагменты ДНК с тупыми концами.

Принцип

В этом методе используется присущая ДНК-топоизомеразе I биологическая активность. Биологическая роль топоизомеразы заключается в расщеплении и воссоединении концов суперспиральной ДНК для облегчения репликации. Топоизомераза I вируса коровьей оспы специфически распознает последовательность ДНК 5'-(C/T)CCTT-3'. Во время репликации фермент расщепляет ДНК именно в этой последовательности, раскручивает ДНК и снова лигирует ее по 3'-фосфатной группе тимидинового основания.

Векторы в коммерчески доступных наборах TOPO были добавлены к сайту топоизомеразы, встроенному в кассету бета-галактозидазы, что позволяет осуществлять сине-белое сканирование. Таким образом, вектор заканчивается самосборкой, что приводит к образованию синих колоний, которые не нужно отбирать и секвенировать для потенциальных положительных клонов.

«Типичный конец» клонирования ТОПО ТА

Векторы ТОРО сконструированы таким образом, что они несут эту специфическую последовательность 5´-(C/T)CCTT-3' на двух линейных концах. Линейная векторная ДНК уже содержит фермент топоизомеразу, ковалентно присоединенный к свободным 3'-концам обеих ее цепей. Затем его смешивают с продуктами ПЦР. Когда свободные 5'-концы цепей продукта ПЦР прикрепляются к 3'-концу топоизомеразы каждой цепи вектора, нити ковалентно связываются уже связанной топоизомеразой. Эта реакция протекает эффективно, если этот раствор инкубировать при комнатной температуре с необходимой солью. Различные типы векторов используются для клонирования фрагментов, амплифицированных полимеразой Taq или Pfu, поскольку полимераза Taq (в отличие от Pfu) оставляет дополнительный нуклеотид «A» на 3'-конце во время амплификации.

Метод клонирования TA TOPO основан на способности аденина (А) и тимина (Т) (комплементарные пары оснований) на различных фрагментах ДНК гибридизоваться и в присутствии лигазы или топоизомеразы связываться вместе. Вставка создается с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимеразы Taq, полимеразы, которая не обладает корректирующей активностью от 3' до 5' и с высокой вероятностью добавляет одиночный 3'-адениновый выступ к каждому концу продукта ПЦР. Лучше всего, если праймеры для ПЦР будут содержать гуанины на 5'-конце, поскольку это максимизирует вероятность добавления ДНК-полимеразой Taq концевого аденозинового выступа. Термостабильные полимеразы, обладающие обширной экзонуклеазной активностью от 3' до 5', не должны использоваться, поскольку они не оставляют 3'-адениновые выступы. Целевой вектор линеаризуют и разрезают с помощью фермента рестрикции с тупым концом. Затем к этому вектору присоединяется дидезокситимидинтрифосфат (ddTTP) с использованием терминальной трансферазы. Важно использовать ddTTP, чтобы обеспечить добавление только одного остатка Т. Этот хвост оставляет вектор с единственным 3'-нависающим остатком тимина на каждом тупом конце.

«Тупой конец» клонирования TOPO

Полимеразы (такие как Phusion) или ферменты рестрикции, которые образуют тупые концы, также можно использовать для клонирования TOPO. Вместо того, чтобы полагаться на липкие концы, вектор ТОРО с тупыми концами имеет тупые концы, на которых связываются молекулы топоизомеразы. Доступны коммерческие наборы, такие как набор для клонирования Zero Blunt® от Invitrogen.