Начальная ходьба

Прогулка по праймеру — это метод, используемый для клонирования гена (например, гена заболевания) из его известных ближайших маркеров (например, известного гена). В результате он используется при клонировании и секвенировании растений, грибов и млекопитающих с незначительными изменениями. Этот метод, также известный как «направленное секвенирование», использует серию реакций секвенирования по Сэнгеру либо для подтверждения эталонной последовательности известной плазмиды или продукта ПЦР на основе эталонной последовательности (служба подтверждения последовательности), либо для обнаружения неизвестной последовательности полной плазмида или продукт ПЦР путем разработки праймеров для перекрывающихся секвенций (услуга по обнаружению последовательностей). ^{[ 1 ]}

Primer Walking: метод секвенирования ДНК

Прогулка по праймеру - это метод определения последовательности ДНК в диапазоне 1,3–7,0 т.п.н., тогда как прогулка по хромосоме используется для создания клонов уже известных последовательностей гена. ^{[ 2 ]} Слишком длинные фрагменты невозможно секвенировать за одну прочитанную последовательность с использованием метода обрыва цепи . Этот метод работает путем разделения длинной последовательности на несколько последовательных коротких. Представляющая интерес ДНК может представлять собой плазмидную вставку, продукт ПЦР или фрагмент, представляющий собой пробел при секвенировании генома. Термин «прогулка по праймеру» используется там, где основной целью является секвенирование генома. Вместо этого используется термин «ходьба по хромосомам», когда последовательность известна, но нет клона гена. Например, ген заболевания может располагаться рядом со специфическим маркером, таким как RFLP, в последовательности. ^{[ 3 ]} Хромосомное блуждание — это метод, используемый для клонирования гена (например, гена заболевания) из его известных ближайших маркеров (например, известного гена) и, следовательно, используется в умеренных модификациях в проектах клонирования и секвенирования растений, грибов и животных. Другими словами, он используется для поиска, выделения и клонирования определенной последовательности, существующей рядом с геном, который необходимо картировать. В геномных проектах чаще всего используются библиотеки крупных фрагментов, в основном библиотеки бактериальных искусственных хромосом. Чтобы идентифицировать желаемую колонию и выбрать конкретный клон, библиотеку сначала проверяют с помощью желаемого зонда. После скрининга клон перекрывают зондом и картируют перекрывающиеся фрагменты. Эти фрагменты затем используются в качестве нового зонда (короткие фрагменты ДНК, полученные с 3'- или 5'-концов клонов) для идентификации других клонов. Библиотека примерно состоит из 96 клонов, и каждый клон содержит отдельную вставку. Первый зонд идентифицирует λ1 и λ2, поскольку он перекрывает их. Второй зонд, полученный из клонов λ2, используется для идентификации λ3 и так далее. Ориентацию клонов определяют путем рестрикционного картирования клонов. Таким образом, можно было идентифицировать новые хромосомные области, присутствующие вблизи гена. Ходьба по хромосомам требует много времени, и приземление хромосомы является методом выбора для идентификации генов. Этот метод требует открытия маркера, прочно связанного с мутантным локусом. ^{[ 4 ]}

Фрагмент сначала секвенируется, как если бы это был более короткий фрагмент. Секвенирование проводится с каждого конца с использованием либо универсальных праймеров , либо специально разработанных. Это должно идентифицировать первые 1000 или около того оснований. Чтобы полностью секвенировать интересующую область, необходимо разработать и синтезировать новые праймеры (дополнительные к последним 20 основаниям известной последовательности) для получения информации о непрерывной последовательности. ^{[ 5 ]}

Праймерная ходьба и секвенирование дробовика

Прогулка по праймеру является примером направленного секвенирования , поскольку праймер создается из известного участка ДНК и направляет секвенирование в определенном направлении. В отличие от направленного секвенирования, дробовое секвенирование ДНК представляет собой более быструю стратегию секвенирования. ^{[ 6 ]}

Существует техника секвенирования генома из «старых времен». Базовым методом секвенирования является метод обрыва цепи Сэнгера, длина считывания которого может составлять от 100 до 1000 пар оснований (в зависимости от используемых инструментов). Это означает, что вам придется расщеплять более длинные молекулы ДНК, клонировать и впоследствии секвенировать их. Возможны два метода. ^{[ 7 ]}

Первый называется ходьбой по хромосоме (или праймеру) и начинается с секвенирования первого фрагмента. Затем следующий (непрерывный) фрагмент последовательности секвенируется с использованием праймера, который комплементарен концу первой считанной последовательности и так далее. Этот метод не требует большой сборки, но требует много праймеров и работает относительно медленно. ^{[ 8 ]}

Чтобы решить эту проблему, был разработан метод дробового секвенирования. Здесь ДНК разбивается на разные части (не все в одном и том же месте), клонируется и секвенируется с помощью праймеров, специфичных для вектора, используемого для клонирования. Это приводит к перекрывающимся последовательностям, которые затем приходится собирать в одну последовательность на компьютере. Этот метод позволяет распараллелить секвенирование (вы можете подготовить множество реакций секвенирования одновременно и запустить их), что значительно ускоряет процесс, а также позволяет избежать необходимости использования праймеров, специфичных для последовательности. Задача состоит в том, чтобы организовать последовательности в их порядке, поскольку перекрытия здесь не так очевидны. Чтобы решить эту проблему, делается первый черновой вариант, а затем критические области повторно секвенируются с использованием других методов, таких как обход праймера. ^{[ 9 ]}

Процесс

Общий процесс выглядит следующим образом: Праймер , который соответствует началу последовательности ДНК, используется для синтеза короткой цепи ДНК, прилегающей к неизвестной последовательности, начиная с праймера (см. ПЦР ). Новая короткая цепь ДНК секвенируется с использованием метода терминации цепи. Конец секвенированной цепи используется в качестве праймера для следующей части длинной последовательности ДНК, отсюда и термин «ходьба».

Этот метод можно использовать для секвенирования целых хромосом (отсюда и «ходьба по хромосомам»). ^{[ 10 ]} Ходьба по праймерам также послужила основой для разработки секвенирования дробовика , в котором используются случайные праймеры вместо специально выбранных.

См. также

Хромосомные прыжки
Хромосомная посадка
Секвенирование дробовика – альтернативный метод, использующий случайные, а не последовательные подцепи.

Ссылки

^ Компания Азента Лайф Сайенс. «Часто задаваемые вопросы по начальной ходьбе» . web.genewiz.com . Проверено 20 ноября 2021 г. {{cite web}}: |last= имеет общее имя ( справка )
^ ДНК-вирусы: практический подход . Алан Канн. Оксфорд: Нью-Йорк. 2000. ISBN 0-585-48411-2 . OCLC 53956473 . {{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )
^ Канн, Алан (1999). ДНК-вирусы: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963718-8 .
^ Современные применения биотехнологии растений в фармацевтических науках . 2015. doi : 10.1016/c2014-0-02123-5 . ISBN 9780128022214 .
^ Стерки, Фредрик; Лундеберг, Йоаким (2000). «Анализ последовательностей генов и геномов» (PDF) . Журнал биотехнологии . 76 (1): 1–31. дои : 10.1016/s0168-1656(99)00176-5 . ПМИД 10784293 .
^ «ScienceDirect.com | Журналы о науке, здоровье и медицине, полнотекстовые статьи и книги» . www.sciencedirect.com . Проверено 20 ноября 2021 г.
^ «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.
^ «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.
^ «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.
^ Чино, А. Крейг; Джон Карбон (февраль 1979 г.). «Скрининг перекрывающейся гибридизации: выделение и характеристика перекрывающихся фрагментов ДНК, окружающих ген leu2 на хромосоме III дрожжей». Джин . 5 (2): 111–126. дои : 10.1016/0378-1119(79)90097-0 . ПМИД 376402 .

[1] Компания Азента Лайф Сайенс. «Часто задаваемые вопросы по начальной ходьбе» . web.genewiz.com . Проверено 20 ноября 2021 г. {{cite web}}: |last= имеет общее имя ( справка )

[2] ДНК-вирусы: практический подход . Алан Канн. Оксфорд: Нью-Йорк. 2000. ISBN 0-585-48411-2 . OCLC 53956473 . {{cite book}}: CS1 maint: другие ( ссылка )

[3] Канн, Алан (1999). ДНК-вирусы: практический подход . Издательство Оксфордского университета. ISBN 978-0-19-963718-8 .

[4] Современные применения биотехнологии растений в фармацевтических науках . 2015. doi : 10.1016/c2014-0-02123-5 . ISBN 9780128022214 .

[5] Стерки, Фредрик; Лундеберг, Йоаким (2000). «Анализ последовательностей генов и геномов» (PDF) . Журнал биотехнологии . 76 (1): 1–31. дои : 10.1016/s0168-1656(99)00176-5 . ПМИД 10784293 .

[6] «ScienceDirect.com | Журналы о науке, здоровье и медицине, полнотекстовые статьи и книги» . www.sciencedirect.com . Проверено 20 ноября 2021 г.

[7] «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.

[8] «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.

[9] «Генетика. Почему мы используем такие методы секвенирования ДНК, как дробовик?» . Обмен стеками по биологии . Проверено 20 ноября 2021 г.

[10] Чино, А. Крейг; Джон Карбон (февраль 1979 г.). «Скрининг перекрывающейся гибридизации: выделение и характеристика перекрывающихся фрагментов ДНК, окружающих ген leu2 на хромосоме III дрожжей». Джин . 5 (2): 111–126. дои : 10.1016/0378-1119(79)90097-0 . ПМИД 376402 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]