Конкурентная аллель-специфическая ПЦР

Конкурентная аллель-специфическая ПЦР ( KASP ) представляет собой гомогенный вариант генотипирования на основе флуоресценции полимеразной цепной реакции . Он основан на аллель-специфическом удлинении олигонуклеотидов и резонансном переносе энергии флуоресценции для генерации сигнала.

Однонуклеотидный полиморфизм (SNP) возникает, когда один нуклеотид в последовательности ДНК различается у представителей одного и того же вида или парной хромосомы . SNP работают как молекулярные маркеры , которые помогают найти гены, связанные с заболеванием, и используются для секвенирования генотипов. ^{[ 1 ]}

Генотипирование путем секвенирования следующего поколения с использованием SNP является дорогостоящим, трудоемким и требует некоторых недостающих данных. Существует множество других методов SNP, которые можно использовать в зависимости от цели исследования, учитывая пропускную способность, время обработки данных, простоту использования, производительность (чувствительность, надежность, воспроизводимость, точность), гибкость, требования и стоимость. Для обеспечения максимальной производительности крупномасштабных исследований лучше всего выбрать технологию на основе мультиплексных чипов. Технологии мультиплексирования генерируют от 100 до более миллиона SNP за прогон, но их неэкономично использовать для малого и среднего количества SNP. ^{[ 2 ]} Для меньшего количества SNP можно использовать униплексный анализ, такой как KASP.

Методология

Есть три компонента, которые имеют решающее значение для анализа KASP: 1) очищенный образец ДНК, 2) два аллель-специфичных прямых праймера и 3) общий обратный праймер. Для правильной работы метода требуется минимум 5–10 нг извлеченного образца ДНК. Образец ДНК очищается путем добавления смеси химикатов в буферный раствор. ^{[ 2 ]} В первом раунде ПЦР к смеси добавляется смесь праймеров KASP, содержащая два аллель-специфичных прямых праймера и один обратный праймер. Специфическая природа прямых праймеров позволяет праймеру связываться исключительно с интересующим SNP, позволяя ДНК-полимеразе откладывать остальные комплементарные нуклеотиды . За это время общий обратный праймер начинает откладывать комплементарные нуклеотиды на противоположной цепи ДНК. На этом заканчивается первый раунд ПЦР. ^{[ 2 ]}

Во втором раунде ПЦР цепь, комплементарная аллель-специфичному прямому праймеру, генерируется, когда общий обратный праймер связывается с ампликоном, образовавшимся в первом раунде ПЦР. Наконец, термоцикл реакции ПЦР продолжается, начиная третью часть метода KASP. Праймер с флуоресцентной меткой присутствует в мастер-миксе , где он гасится за счет гибридизации с комплементарной частью, имеющей тушитель на конце. Праймер, меченный флуоресцентной меткой, дополняет хвостовую последовательность аллель-специфического прямого праймера, позволяя происходить элонгации. Это происходит несколько раз в ходе термоциклирования, и передача флуоресцентных сигналов становится сильнее по мере того, как в процессе амплификации используется больше флуоресцентных праймеров. Обычно используются флуоресцентные метки FAM и HEX. ^{[ 3 ]}

Преимущества и недостатки

Метод KASP более экономичен, чем мультиплексные методы: 15 долларов за анализ против 50 долларов за анализ. Кроме того, время получения результатов с помощью метода KASP гораздо короче, чем с помощью других мультиплексных методов: 24 часа вместо недели. Кроме того, уровень ошибок генотипирования ниже - 0,7-1,6%. Метод KASP более гибок, чем другие методы, поскольку его можно использовать, когда в нескольких выборках много SNP или когда во многих выборках мало SNP. Однако мультиплексные методы в настоящее время являются наиболее высокопроизводительными платформами для генотипирования SNP. ^{[ 2 ]}

Приложения

Эта технология имеет множество применений в генотипировании контроля качества (QC), картировании локуса количественных признаков (QTL), маркерной селекции (MAS) и интеллектуальном анализе аллелей. Например, платформа KASP использовалась для качественного контрольного анализа кукурузы. В случае кукурузы однородность важна при выращивании культур, выбранных производителем. Незначительные изменения в частотах аллелей могут иметь большое влияние на качество урожая и могут происходить по-разному, в том числе через перекрестное загрязнение пыльцы и/или семян, а также при регенерации семян. Анализ контроля качества можно использовать на различных мероприятиях, на которых можно ожидать изменения частоты аллелей, при условии, что образцы берутся из родительских поколений и поколений сельскохозяйственных культур F1. Это гарантирует, что частоты аллелей не сильно изменились между двумя поколениями, и обеспечивает чистоту линии на основе установленных SNP для кукурузы. Для кукурузы идентифицировано от 50 до 100 SNP, которые можно использовать для проведения такого типа анализа. ^{[ 2 ]}

Анализ качества (анализ КК) используется для поддержания чистоты инбредной линии. Протокол генотипирования QC использует 50–100 SNP для определения неоднородности образца и установления генетической идентичности. Контроль качества можно использовать в любой момент разведения.

Если контроль качества должен использоваться для картирования популяции, неродительские аллели отбрасываются, а аллели, для которых более 90% SNP полиморфны между родителями, сохраняются.

QTL-картирование

Картирование QTL идентифицирует подмножество маркеров, которые в значительной степени связаны с одним или несколькими QTL, влияющими на экспрессию интересующего признака.

Выберите или разработайте картографическую популяцию с двумя родителями.
Фенотипирование популяции по признаку в тепличных или полевых условиях.
Выберите систему молекулярной маркировки — генотипы родителей картируемой популяции и F1 с большим количеством маркеров, затем выберите 200-400 маркеров, демонстрирующих полиморфизм между родителями.
Выберите подход к генотипированию, а затем сгенерируйте молекулярные данные для полиморфных маркеров.
Определите молекулярные маркеры, связанные с основными QTL, с помощью статистических программ.

Для картирования QTL у кукурузы:

используйте KASP для генотипирования родителей и F1 с 1250 SNP
Определите полиморфные SNP
Генотипируйте всю популяцию с помощью полиморфных SNP.

Ссылки

^ «Что такое однонуклеотидные полиморфизмы (SNP)?» . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 7 апреля 2014 г.
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Семан, Касса; Бабу, Раман; Хирн, Сара; Олсен, Майкл (10 июля 2013 г.). «Генотипирование однонуклеотидного полиморфизма с использованием конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP): обзор технологии и ее применение для улучшения сельскохозяйственных культур». Молекулярная селекция . 33 (1): 1–14. дои : 10.1007/s11032-013-9917-x . S2CID 14272035 .
^ «Как работает КАСП?» . LGC Геномика . Проверено 7 апреля 2014 г.

[1] «Что такое однонуклеотидные полиморфизмы (SNP)?» . Национальная медицинская библиотека США . Проверено 7 апреля 2014 г.

[Semagn-2] Jump up to: ^а ^б ^с ^д ^и Семан, Касса; Бабу, Раман; Хирн, Сара; Олсен, Майкл (10 июля 2013 г.). «Генотипирование однонуклеотидного полиморфизма с использованием конкурентной аллель-специфической ПЦР (KASP): обзор технологии и ее применение для улучшения сельскохозяйственных культур». Молекулярная селекция . 33 (1): 1–14. дои : 10.1007/s11032-013-9917-x . S2CID 14272035 .

[3] «Как работает КАСП?» . LGC Геномика . Проверено 7 апреля 2014 г.

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]