Подавление ионов в жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии
 | В этой статье есть несколько проблем. Пожалуйста, помогите улучшить его или обсудите эти проблемы на странице обсуждения . ( Узнайте, как и когда удалять эти шаблонные сообщения )
|
Подавление ионов в ЖХ-МС и ЖХ-МС/МС относится к уменьшенному отклику детектора или сигналу: шуму как проявленному эффекту конкуренции за эффективность ионизации в источнике ионизации между интересующим аналитом(ами) и другими эндогенными или экзогенными ( например, пластификаторы, извлеченные из пластиковых трубок, [ 1 ] добавки подвижной фазы) виды, которые не были удалены из матрицы пробы во время подготовки пробы . Подавление ионов не является строго проблемой, если мешающие соединения не элюируются одновременно с интересующим аналитом. В тех случаях, когда вещества, подавляющие ионы, элюируются совместно с аналитом, влияние на важные аналитические параметры, включая прецизионность, достоверность и предел обнаружения (аналитическую чувствительность), может быть значительным, что серьезно ограничивает достоверность результатов анализа. [ 2 ]
История
[ редактировать ]С момента своего появления в качестве инструмента аналитической химии ЖХ-МС/МС быстро распространилась и продолжает распространяться (помимо других) в биоаналитических областях. Одним из преимуществ метода является его селективность по отношению ко многим интересующим аналитам. Однако такая высокая селективность может привести к неправильному представлению о том, что всегда можно упростить или (иногда) почти полностью исключить необходимость тщательной подготовки проб . Однако во время и после внедрения биоаналитических лабораторий во всем мире стало очевидно, что существуют проблемы с обнаружением относительно небольших концентраций аналита в сложных матрицах образцов, связанных с биологическими жидкостями (например, кровью и мочой). [ 3 ]
Предлагаемые механизмы подавления ионов
[ редактировать ]Проще говоря, подавление ионов описывает неблагоприятное воздействие на отклик детектора из-за снижения эффективности ионизации интересующего аналита(ов) в результате присутствия в матрице пробы веществ , которые конкурируют за ионизацию или ингибируют эффективную ионизацию другими способами. Использование МС/МС в качестве средства обнаружения может создать впечатление, что мешающие вещества отсутствуют, поскольку хроматографические примеси не обнаруживаются. Однако виды, которые не являются изобарными, все же могут оказывать неблагоприятное воздействие на чувствительность, точность и прецизионность анализа из-за подавления ионизации интересующего аналита. [ 4 ]
Хотя точные химические и физические факторы, участвующие в подавлении ионов, не до конца понятны, было высказано предположение, что основность, высокая концентрация, масса и, что более интуитивно, совместное элюирование с интересующим аналитом являются факторами, которые не следует игнорировать. [ 5 ]
Наиболее распространенными методами ионизации при атмосферном давлении, используемыми в ЖХ-МС/МС, являются ионизация электрораспылением (ESI) и химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). APCI менее склонен к выраженному подавлению ионов, чем ESI, [ 6 ] неотъемлемое свойство соответствующих механизмов ионизации.
В APCI единственным источником подавления ионов можно считать изменение коллигативных свойств растворенного вещества во время испарения (King et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom 2000, 11, 942-950).
ESI имеет более сложный механизм ионизации, в значительной степени зависящий от избыточного заряда капель, и поэтому существует гораздо больше факторов, которые следует учитывать при изучении причины подавления ионов. Было широко замечено, что для многих аналитов при высоких концентрациях ESI демонстрирует потерю линейности отклика детектора , возможно, из-за уменьшения избыточного заряда, вызванного насыщением аналита на поверхности капли, что препятствует последующему выбросу ионов газовой фазы из глубины капли. . Таким образом, конкуренция за пространство и/или заряд может рассматриваться как источник подавления ионов при ESI. Как физические, так и химические свойства аналитов (например, основность и поверхностная активность) определяют присущую им эффективность ионизации. Матрицы биологических образцов, естественно, имеют тенденцию содержать множество эндогенных видов с высокой основностью и поверхностной активностью, следовательно, общая концентрация этих видов в образце быстро достигнет уровней, при которых следует ожидать подавления ионов.
Другое объяснение подавления ионов при ESI рассматривает физические свойства самой капли, а не ее присутствующие виды. Высокие концентрации мешающих компонентов приводят к увеличению поверхностного натяжения и вязкости, что приводит к снижению десольватации (испарения растворителя), что, как известно, оказывает заметное влияние на эффективность ионизации.
Третья предложенная теория подавления ионов при ESI связана с присутствием нелетучих веществ, которые могут либо вызвать совместное осаждение аналита в капле (таким образом предотвращая ионизацию), либо предотвратить сокращение размера капли до критического радиуса, необходимого для ионизации. механизмы испарения и/или остатка заряда для эффективного образования ионов газовой фазы.
Стоит учитывать, что степень подавления ионов может зависеть от концентрации контролируемого аналита. Более высокое соотношение аналит/матрица может привести к снижению эффекта подавления ионов. [ 7 ]
Оценка подавления ионов во время валидации метода
[ редактировать ] |
Поскольку общепризнано, что подавление ионов потенциально может повлиять на другие аналитические параметры любого анализа, разумный подход к разработке любого метода ЖХ-МС должен включать оценку подавления ионов. Существует два принятых протокола, с помощью которых это может быть достигнуто, и они описаны следующим образом.
Мониторинг реакции детектора при постоянной инфузии
[ редактировать ]Более комплексный подход к оценке подавления ионов заключается в постоянном введении соответствующей концентрации в поток подвижной фазы после аналитической колонки с использованием шприцевого насоса и тройника. Затем типичный образец следует ввести через вход ВЭЖХ в соответствии с обычными аналитическими параметрами.
Мониторинг реакции детектора во время этого эксперимента должен давать постоянный сигнал, соответствующий концентрации введенных видов. После введения образца падение интенсивности сигнала (или отрицательный ответ) должно наблюдаться каждый раз, когда вещество ионизируется в источнике ионов. Это должно позволить определить время удерживания любого такого вещества при аналитических параметрах анализа. Можно считать, что любые виды, вызывающие отрицательный ответ, способствуют подавлению ионов, но только если такие виды совместно элюируют с интересующим аналитом.
Также важно учитывать, что вещества, способствующие подавлению ионов, могут удерживаться колонкой в гораздо большей степени, чем интересующий аналит. С этой целью реакцию детектора следует контролировать в течение нескольких раз превышающего обычное время хроматографического анализа, чтобы гарантировать, что подавление ионов не повлияет на последующие инъекции.
Подготовка образцов плазмы с добавлением добавок
[ редактировать ]Другой подход к оценке подавления ионов заключается в сравнении:
- Отклик детектора калибровочного стандарта (водного или в другом подходящем растворителе). Это дает наилучший сценарий отклика детектора, т.е. в условиях нулевого подавления ионов.
- Предварительно подготовленная матрица образца с добавлением аналита идентичной концентрации. Это демонстрирует эффект подавления ионов.
- Отклик детектора матрицы пробы, в которую добавлено аналит идентичной концентрации и подвергнуто обычной процедуре подготовки пробы. Это может продемонстрировать разницу между любой потерей сигнала из-за недостаточного восстановления в процессе подготовки пробы и истинным подавлением ионов.
Подходы к устранению подавления ионов
[ редактировать ] |
Существует несколько стратегий устранения и/или устранения подавления ионов. Эти подходы могут потребовать глубокого понимания механизмов ионизации, задействованных в различных источниках ионизации , или могут быть полностью независимыми от задействованных физических факторов.
Хроматографическое разделение
[ редактировать ]Если хроматографическое разделение можно изменить, чтобы предотвратить коэлюцию подавляющих частиц, то нет необходимости рассматривать другие подходы. Эффект хроматографической модификации можно оценить с помощью мониторинга реакции детектора при методе постоянной инфузии, описанном ранее.
Подготовка проб
[ редактировать ]Эффективный протокол подготовки проб, обычно включающий либо жидкостно-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ), либо твердофазную экстракцию (ТФЭ), а часто и дериватизацию, может удалить ионоподавляющие соединения из матрицы пробы перед анализом. Эти общие подходы могут также устранить другие помехи, такие как изобарические виды.
Осаждение белка — еще один метод, который можно использовать для анализа малых молекул. Удаление всех видов белка из матрицы образца может быть эффективным в некоторых случаях, хотя для многих аналитов виды, подавляющие ионы, не имеют белкового происхождения, поэтому этот метод часто используется в сочетании с экстракцией и дериватизацией.
Концентрация пробы и скорость потока подвижной фазы
[ редактировать ]Разбавление пробы или уменьшение объема вводимой пробы может привести к уменьшению подавления ионов за счет уменьшения количества присутствующих мешающих веществ, хотя количество интересующего аналита также будет уменьшено, что делает этот подход нежелательным для анализа следов.
Аналогичным является эффект от снижения скорости потока подвижной фазы до диапазона нанолитр в минуту, поскольку, помимо улучшения десольватации, образующиеся более мелкие капли более устойчивы к присутствию нелетучих частиц в матрице образца.
Методы калибровки для компенсации подавления ионов
[ редактировать ]Не всегда возможно устранить подавление ионов путем подготовки проб и/или хроматографического разрешения. В таких случаях можно компенсировать влияние подавления ионов на точность и точность (но не на аналитическую чувствительность) путем принятия сложных стратегий калибровки.
Калибровочные стандарты, соответствующие матрице
[ редактировать ]Использование калибровочных стандартов, соответствующих матрице, может компенсировать подавление ионов. Используя этот метод, калибровочные стандарты готовятся в матрице образца, идентичной той, которая используется для анализа (например, в плазме), путем добавления в обычный образец известных концентраций аналита. Это не всегда возможно для биологических образцов, поскольку интересующий аналит часто присутствует эндогенно в клинически значимом, хотя и нормальном, количестве. Чтобы калибровочные стандарты, соответствующие матрице, эффективно компенсировали подавление ионов, матрица образца не должна содержать интересующего аналита. Кроме того, важно, чтобы состав испытуемого образца не менялся, поскольку и испытуемый образец, и приготовленный калибровочный образец должны одинаково подвергаться подавлению ионов. Опять же, в сложных биологических образцах от разных людей или даже от одного и того же человека в разное время могут наблюдаться большие колебания концентрации ионов, подавляющих виды.
Стандартное дополнение
[ редактировать ]Стандартный метод добавления предполагает добавление в один и тот же экстракт образца нескольких известных концентраций аналита. Этот метод более надежен и эффективен, чем использование стандартов, соответствующих матрице, но является трудоемким, поскольку для достижения надежной калибровки каждый образец необходимо готовить несколько раз.
Внутренний стандарт
[ редактировать ]При этом подходе в образец добавляется определенный вид ( внутренний стандарт ), который используется для нормализации реакции аналита, компенсируя переменные на любом этапе подготовки и анализа образца, включая подавление ионов.
Важно, чтобы внутренний стандарт проявлял очень схожие (идеально идентичные) свойства в отношении отклика детектора (т.е. ионизации) с интересующим аналитом. Чтобы упростить выбор внутреннего стандарта, большинство лабораторий используют аналогичный стабильный изотоп при анализе типа изотопного разбавления . Стабильный изотоп практически гарантированно химически и физически максимально близок к интересующему аналиту, что обеспечивает почти идентичный отклик детектора, а также идентичное поведение во время подготовки проб и хроматографического разрешения. С этой целью подавление ионов, испытываемое аналитом и внутренним стандартом, должно быть идентичным. Важно отметить, что чрезмерно высокая концентрация внутреннего стандарта стабильного изотопа может сама по себе вызвать подавление ионов, поскольку он будет элюироваться совместно с интересующим аналитом. Следовательно, внутренний стандарт следует добавлять в соответствующей концентрации.
Выбор источника ионизации
[ редактировать ]Как обсуждалось ранее, APCI обычно менее подвержен подавлению ионов, чем ESI. Там, где это возможно, если подавление ионов неизбежно, может быть целесообразным перейти с ESI на APCI. Если это невозможно, может оказаться полезным переключить режим ионизации ESI с положительного на отрицательный. Поскольку в режиме отрицательной ионизации ионизируется меньше соединений, вполне возможно, что вещества, подавляющие ионы, могут быть удалены из анализа. Однако следует также учитывать, что интересующий аналит не может быть эффективно ионизирован и в отрицательном режиме, что делает этот подход бесполезным.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Мэй, Х; Нардо С; Сюй Х; Ван С; Нг К; Корфмахер В.А. (ноябрь 2002 г.). «Исследование матричных эффектов в биоаналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии / тандемном масс-спектрометрическом анализе: применение к открытию лекарств». Быстрая связь в масс-спектрометрии . 17 (1): 97–103. Бибкод : 2003RCMS...17...97M . дои : 10.1002/rcm.876 . ПМИД 12478560 .
- ^ Фьюри, Эмброуз; Мериса Мориарти; Вайшали Бэйн; Брайан Кинселла; Мэри Лехан (октябрь 2013 г.). «Подавление ионов; критический обзор причин, оценки, предотвращения и применения». Таланта . 115 : 104–122. дои : 10.1016/j.talanta.2013.03.048 . ПМИД 24054567 .
- ^ Джессом, Лори Ли; Волмер Д. (май 2006 г.). «Подавление ионов: основная проблема масс-спектрометрии» . LCGC Северная Америка . 24 (5).
- ^ Бурман, Дебора Л; Цена ПИ; Рудевич П.Я. (ноябрь 1996 г.). «Количественное определение SR 27417 в плазме человека с использованием электрораспылительной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии: исследование ионного подавления» . J Am Soc Масс-спектр . 7 (11): 1099–1105. дои : 10.1016/s1044-0305(96)00072-4 . ПМИД 24203071 .
- ^ Аннесли, Томас М. (июль 2003 г.). «Подавление ионов в масс-спектрометрии» . Клиническая химия . 49 (7): 1041–1044. дои : 10.1373/49.7.1041 . ПМИД 12816898 .
- ^ Брюинз CH, Джеронимус-Стратинг CM, Энсинг К., ван Донген WD, де Йонг GJ (ноябрь 1999 г.). «Онлайн-сочетание твердофазной экстракции с масс-спектрометрией для анализа биологических образцов. I. Определение кленбутерола в моче». Дж Хроматогр А. 863 (1): 115–122. дои : 10.1016/S0021-9673(99)00959-0 . ПМИД 10591469 .
- ^ Ван Хаут, MW; Хофланд CM; Нидерлендер ХА; де Йонг Дж.Дж. (2000). «Онлайн-сочетание твердофазной экстракции с масс-спектрометрией для анализа биологических образцов. II. Определение кленбутерола в моче с помощью многоступенчатой масс-спектрометрии в масс-спектрометре с ионной ловушкой». Быстрая связь в масс-спектрометрии . 14 (22): 2103–2111. doi : 10.1002/1097-0231(20001130)14:22<2103::AID-RCM138>3.0.CO;2-V . ПМИД 11114016 .