Фокальная молография
Фокальная молография («молография» вкратце) — это биофизический метод надежного и чувствительного обнаружения биомолекулярных взаимодействий без использования меток. Новый метод позволяет анализировать биомолекулярные взаимодействия в сложных биологических образцах без использования дополнительных флуоресцентных меток. Молография расширяет аналитические возможности методов анализа биомолекулярных взаимодействий в широком диапазоне приложений, например, безметочный анализ следов целевой молекулы (так называемого биомаркера) в сложных образцах, таких как сыворотка крови, жидкость биореактора или среда клеточной культуры. В отличие от рефрактометрических методов анализа биомолекулярных взаимодействий без меток, таких как поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и рефлектометрическая интерференционная спектроскопия (RIfS) , молография позволяет количественно определять молекулярные взаимодействия в живых клетках в реальном времени.
Принцип
[ редактировать ]Принцип работы молографии показан на рисунке 1. Молография основана на дифракции лазерного света на специальном двумерном наноструктуре мест молекулярного связывания на поверхности сенсорного чипа, называемом молограммой. [1] [2] [3] Молограмма — это последовательная совокупность сайтов связывания на чипе, которые образуют схему молекулярной голограммы. [3] [1] [2] Голограмма имеет форму фокусирующей дифракционной линзы и освещается затухающей волной. Затухающие волны возникают, когда свет полностью внутренне отражается на границе раздела двух диэлектриков. [4] [5] Биомолекулы, которые связываются с молограммой, преломляют лазерный свет в ограниченное дифракцией фокальное пятно в трехмерном пространстве, фокусную точку молограммы. [3] [1] [2] Интенсивность сфокусированного света квадратично коррелирует с количеством связанных молекул на молограмме и, следовательно, с количеством происходящих биомолекулярных взаимодействий. [4] [5]
В сложных биологических образцах концентрация нецелевых молекул обычно значительно выше, чем целевых молекул. Поэтому даже при отсутствии элементов распознавания нецелевые молекулы легко адсорбируются на поверхности сенсора. [3] [1] [2] Однако это случайный процесс, и нецелевые молекулы не связываются с упорядоченными сайтами связывания молограммы. [3] [1] [2] Таким образом, рассеяние нецелевых молекул является равномерным во всех пространственных направлениях, и поэтому нецелевые молекулы практически не вносят вклад в измеряемую интенсивность света в узком телесном угле фокального пятна. [3] [1] [2] По сути, фокальная молография формирует высокочастотную блокировку пространственного сродства, которая измеряет только компонент Фурье распределения показателя преломления, который соответствует модуляции связывания молограммы. [6] Поскольку шум окружающей среды (градиенты температуры, изменения буфера и неспецифическое связывание нецелевых молекул) обратно пропорционален пространственной частоте и, следовательно, расположен в основном в «длинных» пространственных периодах, большая часть шума может быть отклонена. Это свойство делает молографию чрезвычайно надежной и делает стабилизацию температуры или уравновешивание датчиков устаревшими. [7]
История
[ редактировать ]Кристоф Фаттингер из Hoffmann-La-Roche в Базеле уже задумал физические принципы фокальной молографии в 1990-х годах, когда исследовал бидифракционную решетку-связку. [1] [8] [9] Однако оно появилось только в результате научного сотрудничества между ETH Zürich и Инновационным центром Roche в Базеле в Швейцарии с 2014 по 2020 год.
Реализация: специальный фотолитографический метод позволяет синтезировать молограммы.
[ редактировать ]Синтез молограмм на сенсорном чипе осуществляется с помощью правильно разработанной химии поверхности и реактивной иммерсионной литографии (RIL). [3] [10] С помощью процесса RIL структура биомолекулярного распознавания молограммы на светочувствительном, необрастающем слое привитого сополимера может быть создана с помощью стандартных методов литографии. [3] [10] [11] Слой сополимера функционализирован фоторасщепляемыми защитными группами, которые при освещении создают реакционноспособные амины. [1] [3] [10] Последующие этапы химии поверхности позволяют легко адаптировать молекулы распознавания, специфичные для желаемого аналитического применения. [10] [12] [13] [14]
Применение метода молографии
[ редактировать ]Устойчивость фокальной молографии к шуму окружающей среды придает этому методу платформенный характер, который допускает множество возможных применений. [15] Они варьируются от изучения специфического биомолекулярного взаимодействия в фундаментальных биологических исследованиях до диагностики критического состояния здоровья в чрезвычайной ситуации. [3] [10]
Биологические применения молографии делятся на пять основных классов:
- Классический анализ биомолекулярного взаимодействия (BIA), [16] т.е. измерение скоростей включения, снижения скорости и констант связывания, как показано в, [10]
- Количественное определение биомаркеров в биологических образцах, [10]
- Профилирование низкоаффинных связующих на массивах молограмм, [13]
- Количественная оценка молекулярных взаимодействий в живых клетках в реальном времени, [12] [14] и
- Открытие неизвестных биомолекулярных взаимодействий с помощью анализов связывания. [1]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я Фаттингер, Кристоф (11 августа 2014 г.). «Фокальная молография: когерентное микроскопическое обнаружение биомолекулярного взаимодействия» . Физический обзор X . 4 (3): 031024. Бибкод : 2014PhRvX...4c1024F . дои : 10.1103/PhysRevX.4.031024 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж Бинниг, Герд (11 августа 2014 г.). «Когерентный сигнал определяет биомолекулярные взаимодействия» . Физика . 7 : 84. Бибкод : 2014PhyOJ...7...84B . дои : 10.1103/Физика.7.84 . ISSN 1943-2879 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г час я дж Фаттингер, Кристоф, Фрутигер, Андреас. «Фокальная молография – оптический метод безметочного обнаружения биомолекулярных взаимодействий» .
{{cite web}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка ) - ^ Jump up to: а б Бликенсторфер, Ив; Мюллер, Маркус; Дрейфус, Роланд; Райхмут, Андреас Михаэль; Фаттинджер, Кристоф; Фрутигер, Андреас (09 марта 2021 г.). «Количественное дифрактометрическое биосенсорство» . Применена физическая проверка . 15 (3): 034023. arXiv : 2011.15052 . Бибкод : 2021PhRvP..15c4023B . doi : 10.1103/PhysRevApplied.15.034023 . S2CID 227239388 .
- ^ Jump up to: а б с Фрутигер, Андреас; Бликенсторфер, Ив; Бишоф, Сильвио; Форро, Чаба; Лауэр, Матиас; Гаттердам, Волкер; Фаттинджер, Кристоф; Вёрёш, Янош (28 января 2019 г.). «Принципы чувствительного и надежного анализа биомолекулярных взаимодействий: пределы обнаружения и разрешения дифракционно-ограниченной фокальной молографии» . Применена физическая проверка . 11 (1): 014056. arXiv : 1808.07956 . Бибкод : 2019PhRvP..11a4056F . doi : 10.1103/PhysRevApplied.11.014056 . S2CID 55876475 .
- ^ Фрутигер, Андреас; Фаттинджер, Кристоф; Вёрёш, Янош (январь 2021 г.). «Сверхстабильные молекулярные датчики с помощью субмикронной привязки и почему их следует исследовать с помощью оптической дифракции - Часть I. Концепция синхронного усилителя с пространственным сродством» . Датчики . 21 (2): 469. Бибкод : 2021Senso..21..469F . дои : 10.3390/s21020469 . ПМЦ 7827303 . ПМИД 33440783 .
- ^ Фрутигер, Андреас; Гаттердам, Карл; Бликенсторфер, Ив; Райхмут, Андреас Михаэль; Фаттинджер, Кристоф; Вёрёш, Янош (январь 2021 г.). «Сверхстабильные молекулярные датчики, полученные методом субмикронной привязки, и почему их следует исследовать методом оптической дифракции - Часть II. Экспериментальная демонстрация» . Датчики . 21 (1): 9. дои : 10.3390/s21010009 . ПМЦ 7792590 . ПМИД 33375003 .
- ^ Фэттингер, Ч. (29 марта 1993 г.). «Бидифракционная решетчатая муфта» . Письма по прикладной физике . 62 (13): 1460–1462. Бибкод : 1993ApPhL..62.1460F . дои : 10.1063/1.108658 . ISSN 0003-6951 .
- ^ Спинке, Дж.; Орант, Н.; Фэттинджер, Ч.; Коллер, Х.; Мангольд, К.; Фогелин, Д. (1 марта 1997 г.). «Бидифракционная решётка: применение в иммунозондировании» . Датчики и исполнительные механизмы B: Химические вещества . 39 (1–3): 256–260. дои : 10.1016/S0925-4005(97)80214-6 . ISSN 0925-4005 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Гаттердам, Волкер; Фрутигер, Андреас; Стенгеле, Клаус-Петер; Хайндль, Дитер; Любберс, Томас; Вёрёш, Янош; Фаттингер, Кристоф (ноябрь 2017 г.). «Фокальная молография — новый метод in situ анализа молекулярных взаимодействий в биологических образцах» . Природные нанотехнологии . 12 (11): 1089–1095. Бибкод : 2017НатНа..12.1089Г . дои : 10.1038/nnano.2017.168 . ISSN 1748-3395 . ПМИД 28945239 . S2CID 19162408 .
- ^ Фрутигер, Андреас; Чаненнен, Кла Дури; Бликенсторфер, Ив; Райхмут, Андреас М.; Фаттинджер, Кристоф; Вёрёш, Янош (01 декабря 2018 г.). «Реактивная иммерсионная литография с обращением изображения улучшает предел обнаружения фокальной молографии» . Оптические письма . 43 (23): 5801–5804. Бибкод : 2018OptL...43.5801F . дои : 10.1364/OL.43.005801 . ISSN 1539-4794 . ПМИД 30499945 . S2CID 54164956 .
- ^ Jump up to: а б Райхмут, Андреас Михаэль; Циммерманн, Мирьям; Вильгельм, Флориан; Фрутигер, Андреас; Бликенсторфер, Ив; Фаттинджер, Кристоф; Вальдхёр, Мария; Вёрёш, Янош (07.07.2020). «Количественная оценка молекулярных взаимодействий в живых клетках в реальном времени с использованием наноструктуры мембранных белков» . Аналитическая химия . 92 (13): 8983–8991. дои : 10.1021/acs.analchem.0c00987 . ISSN 0003-2700 . ПМИД 32524822 . S2CID 219588419 .
- ^ Jump up to: а б Райхмут, Андреас М.; Кубрих, Катарина; Бликенсторфер, Ив; Фрутигер, Андреас; Момотенко Дмитрий; Гаттердам, Волкер; Трейндл, Фридолин; Фаттинджер, Кристоф; Вёрёш, Янош (26 марта 2021 г.). «Исследование сложных образцов с монограммами малоаффинных связующих» . Датчики СКУД . 6 (3): 1067–1076. doi : 10.1021/acsensors.0c02346 . hdl : 20.500.11850/478111 . ПМИД 33629586 . S2CID 232047435 .
- ^ Jump up to: а б Инкавилья, Илария; Фрутигер, Андреас; Бликенсторфер, Ив; Трейндл, Фридолин; Аммирати, Джулия; Люхтефельд, Инес; Драйер, Биргит; Плюктун, Андреас; Вёрёш, Янош; Райхмут, Андреас М (23 апреля 2021 г.). «Подход к количественной оценке цитозольных белок-белковых взаимодействий в живых клетках в реальном времени» . Датчики СКУД . 6 (4): 1572–1582. arXiv : 2011.13462 . doi : 10.1021/acsensors.0c02480 . ПМИД 33759497 . S2CID 232338457 .
- ^ Фрутигер, Андреас (2021). Молекулярные голограммы - Принципы проектирования робастных биосенсоров на примере фокальной молографии (докторская диссертация). ETH Цюрих. дои : 10.3929/ethz-b-000474270 . hdl : 20.500.11850/474270 .
- ^ Хубер, Уолтер; Мюллер, Фрэнсис (1 ноября 2006 г.). «Анализ биомолекулярного взаимодействия при открытии лекарств с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса» . Текущий фармацевтический дизайн . 12 (31): 3999–4021. дои : 10.2174/138161206778743600 . ПМИД 17100609 .