Система экспрессии Т7
Система экспрессии Т7 используется в области микробиологии для клонирования рекомбинантной ДНК с использованием штаммов E. coli . [ 1 ] Это самая популярная система экспрессии рекомбинантных белков в E. coli. [ 2 ]
К 2021 году эта система была описана более чем в 220 000 научных публикациях. [ 3 ]
Разработка
[ редактировать ]Секвенирование и аннотирование генома бактериофага Т7 проводились в 1980-х годах в энергетики США Министерства Брукхейвенской национальной лаборатории под руководством старшего биофизика Ф. Уильяма Стьюдиера . Вскоре лаборатория смогла клонировать РНК-полимеразу Т7 и использовать ее вместе с мощным промотором Т7 для транскрипции большого количества практически любого гена. [ 4 ] Разработка системы экспрессии Т7 считается самой успешной биотехнологией, разработанной в Брукхейвенской национальной лаборатории; ее лицензируют более 900 компаний, что принесло лаборатории более 55 миллионов долларов. [ 5 ]
Механизм
[ редактировать ]Вектор экспрессии, чаще всего вектор экспрессии pET, спроектирован так, чтобы интегрировать два основных компонента: промотор Т7 и представляющий интерес ген, расположенный ниже промотора и под его контролем. Вектор экспрессии трансформируют в один из нескольких соответствующих штаммов E.coli, чаще всего BL21(DE3). Клетка E. coli также имеет собственную хромосому, которая обладает геном, который экспрессируется для производства РНК-полимеразы Т7 . (Эта полимераза происходит от фага Т7 , бактериофага вируса- , который инфицирует бактериальные клетки E. coli и способен интегрировать свою ДНК в ДНК хозяина, а также подавлять его клеточный механизм для производства большего количества своих копий.) РНК-полимераза Т7 ответственный за начало транскрипции на промоторе Т7 трансформированного вектора. Ген Т7 сам находится под контролем lac-промотора. В норме и lac-промотор, и промотор Т7 репрессируются в клетках E. coli с помощью Lac-репрессора . Чтобы инициировать транскрипцию, индуктор должен связаться с lac-репрессором и не дать ему ингибировать экспрессию гена Т7. Как только это произойдет, ген можно будет нормально транскрибировать с образованием РНК-полимеразы Т7. РНК-полимераза Т7, в свою очередь, может связываться с промотором Т7 вектора экспрессии и начинать транскрипцию нижележащего интересующего гена. Для стимуляции этого процесса индуктор IPTG можно добавить в систему. IPTG представляет собой реагент, который имитирует структуру аллолактозы и, следовательно, может связываться с lac-репрессором и предотвращать ингибирование им экспрессии генов. Как только добавляется достаточное количество IPTG, ген Т7 обычно транскрибируется, и поэтому также начинается транскрипция интересующего гена ниже промотора Т7. [ 6 ] Экспрессия рекомбинантного белка под контролем промотора Т7 в 8 раз быстрее, чем экспрессия белка под контролем РНК-полимеразы E. coli. [ 7 ] Базальные уровни экспрессии РНК-полимеразы Т7 в клетке также ингибируются лизоцимом бактериофага Т7, что приводит к задержке накопления РНК-полимеразы Т7 до тех пор, пока лизоцимная активность не достигнет насыщения. [ 8 ]
Приложение
[ редактировать ]Во время пандемии COVID-19 и -вакцины мРНК компании Moderna Pfizer разработали для борьбы с распространением вируса. И Moderna, и Pfizer использовали систему экспрессии T7 для создания больших количеств мРНК, необходимых для производства вакцин. [ 9 ] [ 4 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Альбертс, Брюс (2002). «Глава 7.6». Молекулярная биология клетки . Александр Джонсон, Джулиан Льюис, Мартин Рафф, Кейт Робертс, Питер Уолтер (4-е изд.). Нью-Йорк: Garland Science. ISBN 0-8153-3218-1 . OCLC 48122761 .
- ^ Биолаборатории Новой Англии. «Экспрессия Т7». Доступ осуществлен 4 октября 2021 г. Доступно .
- ^ Шиллинг, Патрик Дж.; Мирзаде, Киаваш; Камминг, Алистер Дж.; Видешхайм, Магнус; Кёк, Зоя; Дэйли, Дэниел О. (07 мая 2020 г.). «Улучшенная конструкция экспрессирующих плазмид pET увеличивает выход белка в Escherichia coli» . Коммуникационная биология . 3 (1): 214. дои : 10.1038/s42003-020-0939-8 . ISSN 2399-3642 . ПМК 7205610 . ПМИД 32382055 .
- ^ Перейти обратно: а б Карен МакНалти Уолш. «Наука, стоящая за выстрелом: биотехнологические инструменты, разработанные в Брукхейвенской лаборатории, имеют фундаментальное значение для создания вакцин против COVID-19». Брукхейвенская национальная лаборатория. 13 апреля 2021 г. По состоянию на 4 октября 2021 г.
- ^ Дайан Гринберг. «Ф. Уильям Стьюдер: Фундаментальные исследования ведут к самой успешной технологии BNL». Брукхейвенская национальная лаборатория. 7 апреля 2011 г. По состоянию на 4 октября 2021 г. Доступно .
- ^ Тяснинг Кремер. «Как работает индукция IPTG?». ГОЛДБИО. Доступ осуществлен 4 октября 2021 г. Доступно .
- ^ Я, я; Гильерес, Дж; Дрейфус, М. (1992). «РНК-полимераза бактериофага Т7 движется далеко впереди рибосом in vivo» . Журнал бактериологии . 174 (2): 619–622. дои : 10.1128/jb.174.2.619-622.1992 . ISSN 0021-9193 . ПМК 205757 . ПМИД 1729251 .
- ^ Стано, Натали М.; Патель, Смита С. (16 апреля 2004 г.). «Лизоцим Т7 репрессирует транскрипцию РНК-полимеразы Т7 путем дестабилизации открытого комплекса во время инициации *» . Журнал биологической химии . 279 (16): 16136–16143. дои : 10.1074/jbc.M400139200 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 14764584 .
- ^ Карл Макгоуэн. «Случайная компания BNL обнаружила ключевой строительный блок для двух вакцин против COVID-19». НовостиДень. 24 мая 2021 г. По состоянию на 4 октября 2021 г.