Мультифокальная плоскостная микроскопия
 | Эта статья может быть слишком технической для понимания большинства читателей . ( Август 2012 г. ) |
Мультифокальная плоскостная микроскопия ( MUM ), также известная как многоплоскостная микроскопия или многофокусная микроскопия , представляет собой форму световой микроскопии , которая позволяет отслеживать трехмерную динамику в живых клетках с высоким временным и пространственным разрешением путем одновременного отображения различных фокальных плоскостей внутри образца. [1] [2] [3] [4] В этой методологии свет, собранный из образца объективом с коррекцией на бесконечность, разделяется на два пути. [5] На каждом пути разделенный свет фокусируется на детекторе, который расположен на определенном калиброванном расстоянии от линзы трубки. Таким образом, каждый детектор отображает отдельную плоскость внутри образца. Первая разработанная установка MUM была способна отображать две отдельные плоскости внутри образца. Однако установку можно модифицировать для получения изображения более чем в двух плоскостях путем дальнейшего разделения света на каждом пути света и фокусировки его на детекторах, расположенных на определенных калиброванных расстояниях. Позже он был улучшен для получения изображений до четырех различных плоскостей. [6] [7] Для изображения большего количества фокальных плоскостей были разработаны более простые методы, основанные на оптике разделения изображения. Одним из примеров является использование специальной призмы разделения изображений, которая способна захватывать до 8 фокальных плоскостей с использованием всего двух камер. [8] Более того, стандартные готовые частичные светоделители можно использовать для создания так называемой призмы z-делителя, которая позволяет одновременно получать изображения в 9 отдельных фокальных плоскостях с помощью одной камеры. [9] [10] Другой метод, называемый многофокусной микроскопией (МФМ), использует дифракционную оптику Фурье для получения изображений до 25 фокальных плоскостей. [11] [12]
Введение
[ редактировать ]Флуоресцентная микроскопия живых клеток представляет собой важный инструмент в изучении случаев незаконного оборота наркотиков. Традиционная конструкция микроскопа хорошо приспособлена для изображения быстрой клеточной динамики в двух измерениях, т.е. в плоскости фокуса. Однако клетки представляют собой трехмерные объекты, и пути внутриклеточного транспорта обычно не ограничиваются одной фокальной плоскостью. Если динамика не ограничена одной фокальной плоскостью, традиционная технология одноплоскостной микроскопии недостаточна для детального изучения быстрой внутриклеточной динамики в трех измерениях. Классические подходы, основанные на изменении фокальной плоскости, часто не эффективны в таких ситуациях, поскольку фокусирующие устройства работают относительно медленно по сравнению со многими внутриклеточными динамиками. Кроме того, фокальная плоскость часто может оказаться не в том месте и не в то время, тем самым упуская важные аспекты динамических событий.
Выполнение
[ редактировать ]МУМ может быть реализован в любом стандартном световом микроскопе . Пример реализации в микроскопе Zeiss выглядит следующим образом. [13] Двойной видеоадаптер Zeiss сначала подсоединяется к боковому порту микроскопа Zeiss Axiovert 200. Затем два двойных видеоадаптера Zeiss объединяются путем подключения каждого из них к выходным портам первого видеоадаптера Zeiss. К каждому из составных видеоадаптеров ПЗС-камера прикрепляется высокого разрешения с помощью C-образных/проставочных колец и изготовленного по индивидуальному заказу переходника для соединения камеры. Расстояние между выходным портом видеоадаптера и камерой различно для каждой камеры, в результате чего камеры отображают разные фокальные плоскости.
Стоит отметить, что существует множество способов реализации MUM. Упомянутая реализация предлагает ряд преимуществ, таких как гибкость, простота установки и обслуживания, а также возможность настройки для различных конфигураций. Кроме того, для ряда приложений важно иметь возможность получать изображения разных цветов при разном времени экспозиции . Например, для визуализации экзоцитоза в TIRFM необходимо очень быстрое получение данных. Однако для изображения флуоресцентно меченной стационарной органеллы в клетке необходимо низкое возбуждение, чтобы избежать фотообесцвечивания, и в результате получение изображения должно быть относительно медленным. [14] В этом отношении описанная выше реализация обеспечивает большую гибкость, поскольку для получения изображений по разным каналам можно использовать разные камеры.
Трехмерная визуализация со сверхвысоким разрешением и отслеживание отдельных молекул с использованием MUM
[ редактировать ]
Современные методы микроскопии вызвали значительный интерес к изучению клеточных процессов на уровне отдельных молекул. Эксперименты с одиночными молекулами преодолевают эффекты усреднения и, следовательно, предоставляют информацию, которая недоступна при использовании традиционных массовых исследований. Однако трехмерная локализация и отслеживание одиночных молекул создает ряд проблем. Помимо того, можно ли получить изображения отдельной молекулы, пока она подвергается потенциально очень сложной трехмерной динамике, возникает вопрос, можно ли определить трехмерное местоположение одиночной молекулы и насколько точно это можно сделать.
Основным препятствием для высокоточной трехмерной оценки местоположения является плохая способность стандартного микроскопа различать глубину. [15] Даже при использовании объектива с высокой числовой апертурой изображение точечного источника в обычном микроскопе существенно не меняется, если точечный источник перемещается на несколько сотен нанометров от положения фокуса. Это чрезвычайно затрудняет определение осевого положения, т. е. положения по оси Z, точечного источника с помощью обычного микроскопа.
В более общем плане, количественная микроскопия одиночных молекул для 3D-образцов ставит одну и ту же проблему, независимо от того, является ли приложением микроскопия локализации/отслеживания или микроскопия сверхвысокого разрешения , такая как PALM, STORM, FPALM, dSTORM для 3D-приложений, т.е. определение местоположения отдельной молекулы в 3D-приложениях. три измерения. [16] MUM предлагает несколько преимуществ. [17] В MUM изображения точечного источника получаются одновременно на разных уровнях фокусировки. Эти изображения дают дополнительную информацию, которую можно использовать для ограничения положения z точечного источника. Эта ограничивающая информация в значительной степени решает проблему распознавания глубины вблизи фокуса.
местоположение точечного источника Мера 3D-локализации обеспечивает количественную оценку того, насколько точно можно определить . Небольшое числовое значение меры 3D-локализации предполагает очень высокую точность определения местоположения, тогда как большое числовое значение меры 3D-локализации подразумевает очень низкую точность определения местоположения. Для обычного микроскопа, когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса, например, z0 <= 250 нм, трехмерная мера локализации предсказывает очень низкую точность оценки положения z. Таким образом, в обычном микроскопе проблематично осуществлять 3D-слежение, когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса.
С другой стороны, для двухплоскостной установки MUM трехмерная мера локализации обеспечивает неизменно лучшую точность, чем у обычного микроскопа, для диапазона значений z, особенно когда точечный источник находится близко к плоскости фокуса. Непосредственным следствием этого результата является то, что местоположение точечного источника по оси Z может быть определено с относительно одинаковым уровнем точности для диапазона значений z, что благоприятно для трехмерного отслеживания одиночных частиц .
Двухобъективная мультифокальная микроскопия (dMUM)
[ редактировать ]
В приложениях для визуализации одиночных частиц количество фотонов, обнаруженных с флуоресцентной метки, играет решающую роль в количественном анализе полученных данных. В настоящее время эксперименты по отслеживанию частиц обычно проводятся либо на инвертированном, либо на прямом микроскопе, в котором одна линза объектива освещает образец, а также собирает от него сигнал флуоресценции. Обратите внимание, что хотя излучение флуоресценции образца происходит во всех направлениях (т.е. выше и ниже образца), использование одной линзы объектива в этих конфигурациях микроскопа приводит к сбору света только с одной стороны образца. Даже если используется объектив с высокой числовой апертурой, не все фотоны, излучаемые с одной стороны образца, могут быть собраны из-за конечного угла сбора объектива. Таким образом, даже при наилучших условиях визуализации обычные микроскопы собирают лишь часть фотонов, испускаемых образцом.
Для решения этой проблемы можно использовать конфигурацию микроскопа, в которой используются две противоположные линзы объектива, где одна из линз находится в перевернутом положении, а другая — в вертикальном. Эта конфигурация называется двухобъективной микроскопией в многофокальной плоскости (dMUM). [18]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Прабхат, П.; Рам, С.; Уорд, ES; Обер, Р.Дж. (2004). «Одновременная визуализация различных фокальных плоскостей во флуоресцентной микроскопии для изучения клеточной динамики в трех измерениях» . Транзакции IEEE по нанобионаукам . 3 (4): 237–242. дои : 10.1109/TNB.2004.837899 . ПМЦ 2761735 . ПМИД 15631134 .
- ^ Прабхат, П.; Рам, С.; Уорд, ES; Обер, Р.Дж. (2006). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсвелл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.). «Одновременная визуализация нескольких фокальных плоскостей во флуоресцентной микроскопии для изучения клеточной динамики в 3D». Труды SPIE . Трехмерная и многомерная микроскопия: получение и обработка изображений XIII. 6090 : 115–121. Бибкод : 2006SPIE.6090..115P . дои : 10.1117/12.644343 . S2CID 119772837 .
- ^ Демельт, Лейф; Бастианс, Филипп IH (2010). «Пространственная организация внутриклеточной коммуникации: данные визуализации». Nature Reviews Молекулярно-клеточная биология . 11 (6): 440–452. дои : 10.1038/nrm2903 . ПМИД 20485292 . S2CID 12262683 .
- ^ Тахмасби, А.; Рам, С.; Чао, Дж.; Авраам, А.В.; Тан, ФРВ; Уорд, ES; Обер, Р.Дж. (2014). «Проектирование расстояния в фокальной плоскости для микроскопии в мультифокальной плоскости» . Оптика Экспресс . 22 (14): 16706–16721. Бибкод : 2014OExpr..2216706T . дои : 10.1364/OE.22.016706 . ПМК 4162350 . ПМИД 25090489 .
- ^ Бадейростами, М.; Лью, доктор медицины; Томпсон, Массачусетс; Мёрнер, МЫ (2010). «Точность трехмерной локализации функции рассеяния точки двойной спирали в сравнении с астигматизмом и биплоскостью» . Письма по прикладной физике . 97 (16): 161103. Бибкод : 2010ApPhL..97p1103B . дои : 10.1063/1.3499652 . ПМК 2980550 . ПМИД 21079725 .
- ^ Рам, Шрипад; Прабхат, Прашант; Чао, Джерри; Салли Уорд, Э.; Обер, Раймунд Дж. (2008). «Высокоточное 3D-отслеживание квантовых точек с помощью микроскопии в мультифокальной плоскости для изучения быстрой внутриклеточной динамики в живых клетках» . Биофизический журнал . 95 (12): 6025–6043. Бибкод : 2008BpJ....95.6025R . дои : 10.1529/biophysj.108.140392 . ПМК 2599831 . ПМИД 18835896 .
- ^ Далгарно, Пенсильвания; Далгарно, HIC; Путуд, А.; Ламберт, Р.; Патерсон, Л.; Логан, округ Колумбия; Тауэрс, ДП; Уорбертон, Р.Дж.; Гринуэй, АХ (2010). «Многоплоскостная визуализация и трехмерное отслеживание наноразмерных частиц в биологической микроскопии» . Оптика Экспресс . 18 (2): 877–884. Бибкод : 2010OExpr..18..877D . дои : 10.1364/OE.18.000877 . ПМИД 20173908 . S2CID 7701295 .
- ^ Гейссбюлер, С.; Шарипов А.; Годинат, А.; Боккио, Нидерланды; Сандоз, Пенсильвания; Гус, А.; Дженсен, Северная Каролина; Джейкобс, С.; Эндерляйн, Дж.; Гут, ФГ; Дубиковская Е.А.; Лассер, Т.; Лейтенеггер, М. (2014). «Многоплоскостная трехмерная визуализация оптических флуктуаций живых клеток со сверхвысоким разрешением» . Природные коммуникации . 5 : 5830. Бибкод : 2014NatCo...5.5830G . дои : 10.1038/ncomms6830 . ПМК 4284648 . ПМИД 25518894 .
- ^ Сяо, С.; Гриттон, Х.; Ценг, Х.-А.; Земель, Д.; Хан, X.; Мерц, Дж. (2020). «Высококонтрастная многофокусная микроскопия с одной камерой и z-разделительной призмой» . Оптика . 7 (11): 1477–1486. Бибкод : 2020Оптика...7.1477X . дои : 10.1364/OPTICA.404678 . ПМЦ 8443084 . ПМИД 34532564 .
- ^ Сяо, С.; Чжэн, С.; Мерц, Дж. (2021). «Высокоскоростная многофокусная фазовая визуализация в толстых тканях» . Биомедицинская оптика Экспресс . 12 (9): 5782–5792. дои : 10.1364/BOE.436247 . ПМЦ 8515987 . ПМИД 34692215 .
- ^ Абрахамссон, Сара; Чен, Джиджи; Хадж, Басам; Сталлинга, Сьерд; Кацов Александр Юрьевич; Вишневский, Ян; Мизугути, Гаку; Соул, Пьер; Мюллер, Флориан (1 января 2012 г.). «Быстрое получение многоцветных 3D-изображений с использованием многофокусной микроскопии с коррекцией аберраций» . Природные методы . 10 (1): 60–63. дои : 10.1038/nmeth.2277 . ПМК 4161287 . ПМИД 23223154 .
- ^ Абрахамссон, Сара; Маккуилкен, Молли; Мехта, Шалин Б.; Верма, Амитабх; Ларш, Йоханнес; Илич, Роб; Хайнцманн, Райнер; Баргманн, Корнелия И.; Гладфелтер, Эми С. (1 января 2015 г.). «Многофокусный поляризационный микроскоп (MF-PolScope) для трехмерной поляризационной визуализации до 25 фокальных плоскостей одновременно» . Оптика Экспресс . 23 (6): 7734–7754. Бибкод : 2015OExpr..23.7734A . дои : 10.1364/oe.23.007734 . ПМК 5802244 . ПМИД 25837112 .
- ^ «МАМА – Лаборатория Уорда Обера» . ЮТ Юго-Западный . Проверено 19 июля 2012 г.
- ^ Прабхат, П.; Ган, З.; Чао, Дж.; Рам, С.; Ваккаро, К.; Гиббонс, С.; Обер, Р.Дж.; Уорд, ES (2007). «Выяснение путей внутриклеточной рециркуляции, приводящих к экзоцитозу рецептора Fc, FcRn, с помощью микроскопии в мультифокальной плоскости» . Труды Национальной академии наук . 104 (14): 5889–5894. Бибкод : 2007PNAS..104.5889P . дои : 10.1073/pnas.0700337104 . ПМЦ 1851587 . ПМИД 17384151 .
- ^ Рам, С.; Уорд, ES; Обер, Р.Дж. (2005). Николау, Дэн В.; Эндерляйн, Йорг; Лейф, Роберт С; Фаркас, Дэниел Л; Рагхавачари, Рамеш (ред.). «Насколько точно можно локализовать одну молекулу в трех измерениях с помощью флуоресцентного микроскопа?» . Труды SPIE . Визуализация, манипулирование и анализ биомолекул и клеток: основы и приложения III. 5699 : 426–435. Бибкод : 2005SPIE.5699..426R . дои : 10.1117/12.587878 . ПМЦ 2864488 . ПМИД 20448826 .
- ^ «Биплановый микроскоп сверхвысокого разрешения FPALM» .
- ^ Рам, Шрипад; Чао, Джерри; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Салли; Обер, Раймунд Дж. (2007). Кончелло, Хосе-Анхель; Когсвелл, Кэрол Дж; Уилсон, Тони (ред.). «Новый подход к определению трехмерного местоположения микроскопических объектов с применением трехмерного отслеживания частиц». Труды SPIE . Трехмерная и многомерная микроскопия: получение и обработка изображений XIV. 6443 : 6443–0С. Бибкод : 2007SPIE.6443E..0DR . дои : 10.1117/12.698763 . S2CID 121283489 .
- ^ Рам, Шрипад; Прабхат, Прашант; Уорд, Э. Салли; Обер, Раймунд Дж. (2009). «Повышенная точность локализации одиночных частиц с помощью двухобъективной многофокальной микроскопии» . Оптика Экспресс . 17 (8): 6881–6898. Бибкод : 2009OExpr..17.6881R . дои : 10.1364/OE.17.006881 . ПМК 2720637 . ПМИД 19365515 .