хроматофокусирование

Хроматофокусирование — это метод разделения белков, который позволяет разделить отдельные белки и другие амфолиты из сложной смеси в соответствии с различиями в их изоэлектрической точке . В хроматофокусировании используются ионообменные смолы , и его обычно выполняют с помощью быстрой жидкостной хроматографии белков (FPLC) или аналогичного оборудования, способного создавать непрерывные буферные градиенты, хотя это не является обязательным требованием. В отличие от типичной ионообменной хроматографии , где связанные молекулы элюируются из смолы за счет увеличения ионной силы буферной среды, хроматофокусирование элюирует связанные частицы за счет изменения pH буфера. Это изменяет суммарный поверхностный заряд связанных молекул, изменяя их авидность по отношению к смоле. Поскольку изменяющийся pH буферной системы пересекает pI данной молекулы, эта молекула будет элюироваться из смолы, поскольку она больше не будет обладать суммарным поверхностным зарядом (необходимым для молекулярного связывания с ионообменными смолами). Хроматофокусирование — мощный метод очистки белков, поскольку он позволяет различать очень похожие виды, отличающиеся менее чем на 0,05 единиц pH. которые могут плохо разделяться или вообще не разделяться при использовании традиционных стратегий ионного обмена.Основным недостатком этого метода является то, что некоторые белки будут агрегировать, если они присутствуют в относительно высоких концентрациях, и не несут суммарного поверхностного заряда. Это может вызвать закупорку смолы, что весьма проблематично при использовании герметичных колонок с ионообменной смолой в оборудовании FPLC, что приводит к повышению давления и возможному выходу оборудования из строя. Очевидные проблемы агрегации иногда можно преодолеть, ограничивая концентрацию пробы и используя буферные добавки, которые препятствуют образованию агрегатов.