Быстрая белковая жидкостная хроматография
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( март 2021 г. ) |
 Стандартный инструмент FPLC | |
| Акроним | ФПЛК |
|---|---|
| Классификация | Хроматография |
| Производители | Система NGC ( Bio-Rad Laboratories ), Arista ( Practichem ), ÄKTA ( Cytiva ), Contichrom ( ChromaCon ), BioSMB ( Pall Life Sciences ) |
| Другие методы | |
| Связанный | Высокоэффективная жидкостная хроматография Аффинная хроматография Эксклюзионная хроматография по размеру |
Быстрая жидкостная хроматография белков ( FPLC ) — это форма жидкостной хроматографии , которая часто используется для анализа или очистки смесей белков. Как и в других формах хроматографии, разделение возможно, поскольку разные компоненты смеси имеют разное сродство к двум материалам: движущейся жидкости ( подвижная фаза ) и пористому твердому веществу ( неподвижная фаза ). В FPLC подвижной фазой является водный буферный раствор . [1] Расход буфера контролируется поршневым насосом и обычно поддерживается постоянным, в то время как состав буфера можно изменять путем отбора жидкостей в разных пропорциях из двух или более внешних резервуаров. Неподвижная фаза представляет собой смолу , состоящую из шариков, обычно из сшитой агарозы , упакованных в цилиндрическую стеклянную или пластиковую колонку. Смолы FPLC доступны в широком диапазоне размеров гранул и поверхностных лигандов в зависимости от применения.
FPLC был разработан и продан в Швеции компанией Pharmacia в 1982 году. [2] Первоначально она называлась быстрой жидкостной хроматографией в отличие от высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). FPLC обычно применяется только к белкам; однако из-за широкого выбора смол и буферов он имеет широкое применение. В отличие от ВЭЖХ, используемое буферное давление относительно низкое, обычно менее 5 бар , но скорость потока относительно высокая, обычно 1–5 мл/мин.
FPLC можно легко масштабировать от анализа миллиграммов смесей в колонках общим объемом 5 мл и менее до промышленного производства килограммов очищенного белка в колонках объемом во многие литры. При анализе смесей элюент обычно собирают фракциями по 1–5 мл, которые можно подвергнуть дальнейшему анализу. При очистке белка может быть только два контейнера для сбора: один для очищенного продукта, другой для отходов. [3]
Общие принципы
[ редактировать ]В общепринятой стратегии FPLC выбирается смола, с которой интересующий белок будет связываться за счет взаимодействия зарядов в буфере A (рабочий буфер), но диссоциировать и возвращаться в раствор в буфере B (буфер для элюирования). Смесь, содержащую один или несколько интересующих белков, растворяют в 100% буфере А и закачивают в колонку. Интересующие белки связываются со смолой, в то время как другие компоненты переносятся в буфер. [4] Общий расход буфера поддерживается постоянным; однако доля буфера B («буфер для элюирования») постепенно увеличивается от 0% до 100% в соответствии с запрограммированным изменением концентрации («градиент»). В какой-то момент этого процесса каждый из связанных белков диссоциирует и появляется в элюенте . Элюент проходит через два детектора, которые измеряют концентрацию соли (по проводимости) и концентрацию белка (по поглощению ультрафиолетового света с длиной волны 280 нм). Когда каждый белок элюируется, он появляется в элюанте как «пик» концентрации белка и может быть собран для дальнейшего использования. [5]
Компоненты системы
[ редактировать ]Типичный лабораторный СПЛК состоит из одного или двух высокоточных насосов, блока управления, колонки, системы детектирования и коллектора фракций. Хотя системой можно управлять вручную, ее компоненты обычно подключаются к персональному компьютеру или, в более старых моделях, к микроконтроллеру.
Насосы
[ редактировать ]В большинстве систем используются два двухцилиндровых поршневых насоса , по одному на каждый буфер, объединяя производительность обоих в смесительной камере. В некоторых более простых системах используется один перистальтический насос , который закачивает оба буфера из отдельных резервуаров через дозирующий клапан и смесительную камеру. В любом случае система позволяет непрерывно изменять долю каждого буфера, поступающего в колонку. Скорость потока может варьироваться от нескольких миллилитров в минуту в настольных системах до литров в минуту для очистки в промышленном масштабе. Широкий диапазон потоков делает его пригодным как для аналитической, так и для препаративной хроматографии.
Инъекционная петля
[ редактировать ]Инжекционная петля представляет собой сегмент трубки известного объема, который заполняется раствором пробы перед его вводом в колонку. Объем петли может варьироваться от нескольких микролитров до 50 мл и более.
Инжекторный клапан
[ редактировать ]Инжекторный клапан представляет собой клапан с электроприводом, который соединяет смеситель и петлю отбора проб с колонкой. Обычно клапан имеет три положения для загрузки петли пробы, для ввода пробы из петли в колонку и для подключения насосов непосредственно к линии отходов для их промывки или замены буферных растворов. Инъекционный клапан имеет отверстие для загрузки пробы, через которое пробу можно загрузить в инъекционную петлю, обычно из шприца для подкожных инъекций с использованием соединения Люэра .
Столбец
[ редактировать ]Колонка представляет собой стеклянный или пластиковый цилиндр, наполненный шариками смолы и заполненный буферным раствором. Обычно он устанавливается вертикально, при этом буфер движется вниз сверху вниз. Стеклянная фритта в нижней части колонки удерживает шарики смолы в колонке, позволяя буферу и растворенным белкам выходить.
Проточная ячейка
[ редактировать ]Элюент из колонки проходит через одну или несколько проточных ячеек для измерения концентрации белка в элюенте (по поглощению УФ-света при 280 нм). Ячейка проводимости измеряет проводимость буфера, обычно в миллисименсах/см, что указывает на концентрацию соли в буфере. Обычно в комплект поставки также входит проточная ячейка, измеряющая pH буфера. Обычно каждая проточная ячейка подключается к отдельному электронному модулю, который обеспечивает питание и усиливает сигнал.
Монитор/рекордер
[ редактировать ]Проточные кюветы подключены к дисплею и/или устройству записи. В старых системах это был простой самописец, в современных системах используется компьютер с аппаратным интерфейсом и дисплеем. Это позволяет экспериментатору определить, когда возникают пики концентрации белка, указывающие на элюирование определенных компонентов смеси.
Сборщик фракций
[ редактировать ]Сборщик фракций обычно представляет собой вращающуюся стойку, которую можно заполнить пробирками или аналогичными контейнерами. Распределение элюата в отдельные контейнеры определяют по фиксированным объемам или конкретным фракциям, выявляемым при пиках концентрации белка.
Многие системы включают в себя различные дополнительные компоненты. Между смесителем и колонкой можно установить фильтр, чтобы минимизировать засорение. В больших колонках FPLC образец можно загружать в колонку напрямую с помощью небольшого перистальтического насоса, а не через инжекторную петлю. Если буфер содержит растворенный газ, пузырьки могут образовываться при перепаде давления на выходе буфера из колонки; эти пузырьки создают артефакты, если проходят через проточные кюветы. Этого можно избежать путем дегазации буферов, например, с помощью дегазатора , или путем добавления ограничителя потока после проточных ячеек для поддержания давления 1-5 бар в линии элюента.
Столбцы
[ редактировать ]Колонки, используемые в FPLC, представляют собой большие (внутренний диаметр порядка миллиметров) трубки, которые содержат мелкие ( микрометрового масштаба) частицы или шарики геля в качестве неподвижной фазы. [6] Хроматографический слой состоит из шариков геля внутри колонки, а образец вводится в инжектор и переносится в колонку потоком растворителя. В результате того, что различные компоненты прилипают к гелю или диффундируют через него, смесь проб разделяется. [ нужна ссылка ]
Колонки, используемые с FPLC, могут разделять макромолекулы по размеру ( эксклюзионная хроматография ), распределению заряда ( ионный обмен ), гидрофобности, обращенной фазе или биораспознаванию (как при аффинной хроматографии ). [7] Для удобства использования доступен широкий ассортимент предварительно упакованных колонок для таких методов, как ионообменная, гель-фильтрация (фильтрация по размеру), гидрофобное взаимодействие и аффинная хроматография. [8] FPLC отличается от HPLC тем, что колонки, используемые для FPLC, можно использовать только до максимального давления 3–4 МПа (435–580 фунтов на квадратный дюйм). Таким образом, если давление ВЭЖХ можно ограничить, каждую колонку для ВЭЖХ можно также использовать в машине для ВЭЖХ.
Оптимизация очистки белка
[ редактировать ]Для очистки целевой молекулы можно использовать комбинации хроматографических методов. Целью очистки белков с помощью FPLC является доставка количества мишени достаточной чистоты в биологически активном состоянии, пригодном для ее дальнейшего использования. Качество конечного продукта варьируется в зависимости от типа и количества исходного материала, эффективности разделения и селективности очищающей смолы. Конечная цель данного протокола очистки — обеспечить требуемый выход и чистоту целевой молекулы самым быстрым, дешевым и безопасным способом для получения приемлемых результатов. Требуемый диапазон чистоты может варьироваться от уровня, необходимого для основного анализа ( , SDS-PAGE или ELISA например ), при котором удаляются только объемные примеси, до достаточной чистоты для структурного анализа ( ЯМР или рентгеновская кристаллография ), приближающейся к целевому значению >99%. молекула. Требуемая чистота также может означать достаточную чистоту, чтобы сохранить биологическую активность мишени. Эти требования можно использовать для определения количества исходного материала, необходимого для достижения экспериментальной цели. Если исходный материал ограничен и полная оптимизация протокола очистки не может быть выполнена, то ожидается безопасный стандартный протокол, требующий минимальных шагов корректировки и оптимизации. Это может быть неоптимально с точки зрения времени эксперимента, выхода и экономики, но позволит достичь экспериментальной цели. С другой стороны, если исходного материала достаточно для разработки более полного протокола, объем работы для достижения цели разделения зависит от доступной информации об образце и свойств целевой молекулы. Ограничения на разработку протоколов очистки во многом зависят от источника очищаемого вещества, будь то природные источники (например, собранные ткани или организмы), рекомбинантные источники (например, использование прокариотических или эукариотических векторов в их соответствующих системах экспрессии), или полностью синтетические источники.
Никакие хроматографические методы не обеспечивают 100% выход активного материала, а общий выход зависит от количества этапов протокола очистки. Путем оптимизации каждого шага для намеченной цели и организации их таким образом, чтобы свести к минимуму межэтапные обработки, количество шагов будет сведено к минимуму.
Типичный протокол многоступенчатой очистки начинается с предварительного этапа улавливания, на котором часто используется ионообменная хроматография (ИЭК). Смола в среде (неподвижная фаза) состоит из шариков, размер которых варьируется от больших (хорошо для высоких скоростей потока и практически не осветляет образец за счет разрешения) до маленьких (для наилучшего разрешения при прочих равных условиях). . Колонки с короткой и широкой геометрией подходят для высоких скоростей потока, в том числе за счет разрешения, обычно из-за боковой диффузии образца по колонке. Для того чтобы такие методы, как эксклюзионная хроматография, были полезными, необходимы очень длинные, тонкие колонки и минимальные объемы проб (максимум 5% объема колонки). Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC) также может использоваться на первой и/или промежуточной стадиях. Селективность в HIC не зависит от текущего pH и используются нисходящие градиенты соли. Для HIC кондиционирование включает добавление к образцу сульфата аммония для соответствия концентрации буфера А. Если HIC используется перед ИЭК, ионную силу необходимо будет снизить, чтобы она соответствовала ионной силе буфера А для этапа ИЭК путем разбавления, диализа или замены буфера с помощью гель-фильтрации. Вот почему IEC обычно проводится перед HIC, поскольку условия элюирования с высоким содержанием солей для IEC идеальны для связывания со смолами HIC на следующем этапе очистки. Полировка используется для достижения требуемого окончательного уровня очистки и обычно выполняется на гель-фильтрационной колонке. Для повышения чистоты можно добавить дополнительный промежуточный этап очистки или выполнить оптимизацию различных этапов. Этот дополнительный шаг обычно включает в себя еще один этап IEC в совершенно других условиях.
Хотя это пример общего протокола очистки белков, условия буфера, скорости потока и смолы, используемые для достижения конечных целей, могут быть выбраны так, чтобы охватить широкий спектр целевых белков. Такая гибкость необходима для функциональной системы очистки, поскольку все белки ведут себя по-разному и часто отклоняются от прогнозов. [9]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Понтис Х.Г. (01 января 2017 г.). «Глава 3 - Разделение и очистка белков и углеводов». В Понтисе Х.Г. (ред.). Методы анализа обмена углеводов в фотосинтезирующих организмах . Бостон: Академическая пресса. стр. 45–63. дои : 10.1016/b978-0-12-803396-8.00003-x . ISBN 978-0-12-803396-8 .
- ^ Морено-Аррибас М.В. (01 января 2003 г.), «ХРОМАТОГРАФИЯ | Высокоэффективная жидкостная хроматография», в Caballero B, Polo MC (ред.), Энциклопедия пищевых наук и питания (второе издание) , Оксфорд: Academic Press, стр. . 1274–1280, номер документа : 10.1016/b0-12-227055-x/00232-7 , ISBN. 978-0-12-227055-0
- ^ Шихан Д., О'Салливан С. (2003). «Быстрая жидкостная хроматография белков». В Катлере П. (ред.). Протоколы очистки белков . Методы молекулярной биологии. Том. 244. стр. 253–8. дои : 10.1385/1-59259-655-X:253 . ISBN 978-1-59259-655-3 . ПМИД 14970563 .
- ^ Рутковски Дж. М., Шерер П. Е. (01 января 2014 г.). «Выделение и количественное определение комплексов адипонектина высшего порядка». В Макдугалде О (ред.). Методы биологии жировой ткани, Часть А. Методы энзимологии. Том. 537. Академик Пресс. стр. 243–59. дои : 10.1016/b978-0-12-411619-1.00013-6 . ISBN 9780124116191 . ПМК 4040967 . ПМИД 24480350 .
- ^ «Хроматография, теории, FPLC и не только» (PDF) . Архивировано из оригинала (PDF) 28 марта 2014 г. >
- ^ Алуко Р.Э. (январь 2018 г.). «Пептиды, полученные из пищевых белков: производство, выделение и очистка». Белки в пищевой промышленности . Издательство Вудхед. стр. 389–412. дои : 10.1016/b978-0-08-100722-8.00016-4 . ISBN 978-0-08-100722-8 .
- ^ Вербеке К., Вербрюгген А. (июнь 1996 г.). «Полезность быстрой жидкостной хроматографии белков как альтернативы высокоэффективной жидкостной хроматографии препаратов человеческого сывороточного альбумина, меченных 99mTc». Журнал фармацевтического и биомедицинского анализа . 14 (8–10): 1209–13. дои : 10.1016/S0731-7085(95)01755-0 . ПМИД 8818035 .
- ^ Гёке Б., Кейм В. (апрель 1992 г.). «ВЭЖХ и ФПЛХ. Последние достижения в использовании автоматизированных хроматографических систем для разделения секреторных белков поджелудочной железы» . Международный журнал панкреатологии . 11 (2): 109–16. дои : 10.1007/BF02925982 . ПМИД 1607728 . S2CID 92644733 .
- ^ «Справочник по стратегиям очистки белков» (PDF) . GE Healthcare Bio-Sciences AB.
Внешние ссылки
[ редактировать ]Пример оценки рисков FPLC (Leeper Group, Кембриджский университет)