Очистка белка
Очистка белков — это серия процессов, предназначенных для выделения одного или нескольких белков из сложной смеси, обычно клеток , тканей или целых организмов. Очистка белка жизненно важна для уточнения функции, структуры и взаимодействия интересующего белка. Процесс очистки может разделить белковую и небелковую части смеси и, наконец, отделить желаемый белок от всех других белков. В идеале для изучения интересующего белка его необходимо отделить от других компонентов клетки, чтобы загрязняющие вещества не мешали исследованию структуры и функции интересующего белка. [1] Отделение одного белка от всех остальных обычно является наиболее трудоемким аспектом очистки белка. На этапах разделения обычно используются различия в размерах белков, физико-химических свойствах, аффинности связывания и биологической активности . Чистый результат можно назвать изолятом белка .
Цель [ править ]
Себестоимость производства белка остается высокой, и существует растущий спрос на разработку экономически эффективных и быстрых методов очистки белка. Понимание различных методов очистки белка и оптимизация последующей обработки имеют решающее значение для минимизации производственных затрат при сохранении качества на приемлемом уровне гомогенности. [2] Очистка белков бывает препаративная или аналитическая . Препаративная очистка направлена на получение относительно большого количества очищенных белков для последующего использования. Примеры включают получение коммерческих продуктов, таких как ферменты (например, лактаза ), пищевые белки (например, изолят соевого белка ) и некоторые биофармацевтические препараты (например, инсулин ). часто используются несколько стадий препаративной очистки . Для удаления побочных продуктов, таких как белки клеток-хозяев , которые представляют потенциальную угрозу для здоровья пациента, [3] Аналитическая очистка позволяет получить относительно небольшое количество белка для различных исследовательских или аналитических целей, включая идентификацию, количественную оценку и изучение структуры белка , посттрансляционных модификаций и функций. Каждый этап схемы очистки белка контролируется и учитывает уровни очистки и выход. Высокий уровень очистки и низкий выход практически не оставляют белка для экспериментов. С другой стороны, высокий выход при низких уровнях очистки оставляет много примесей (белков, не представляющих интерес), которые мешают исследовательским целям. [1]
Предварительные шаги [ править ]
Извлечение [ править ]
Если интересующий белок не секретируется организмом в окружающий раствор, первым шагом каждого процесса очистки является разрушение клеток, содержащих белок. В зависимости от того, насколько хрупок белок и насколько стабильны клетки, можно, например, использовать один из следующих методов: i) многократное замораживание и оттаивание, ii) обработку ультразвуком , iii) гомогенизацию под высоким давлением ( френч-пресс ), iv ) гомогенизация путем измельчения (шариковая мельница) и v) проницаемость с помощью детергентов (например, Triton X-100 ) и/или ферментов (например, лизоцима ). [4] Наконец, клеточный мусор можно удалить дифференциальным центрифугированием — процедурой, при которой гомогенат центрифугируют на низкой скорости, а затем снова с большей силой, чтобы получить осадок, состоящий из ядер и супернатанта. Это дает несколько фракций с уменьшающейся плотностью, когда к одной фракции применяются более сложные методы очистки. [1]
Также протеазы клеток высвобождаются во время лизиса , которые начинают переваривать белки в растворе. Если интересующий белок чувствителен к протеолизу , рекомендуется действовать быстро и хранить экстракт охлажденным, чтобы замедлить переваривание. Альтернативно, один или несколько ингибиторов протеаз можно добавить в буфер для лизиса непосредственно перед разрушением клеток. Иногда также необходимо добавлять ДНКазу , чтобы уменьшить вязкость клеточного лизата, вызванную высоким содержанием ДНК .
Ультрацентрифугирование [ править ]
Центрифугирование — это процесс, в котором используется центробежная сила для разделения смесей частиц различной массы или плотности, взвешенных в жидкости. Когда сосуд (обычно трубка или бутылка), содержащий смесь белков или других твердых частиц, таких как бактериальные клетки, вращается с высокой скоростью, инерция каждой частицы создает силу в направлении скорости частицы, которая пропорциональна его масса. Тенденция данной частицы двигаться сквозь жидкость под действием этой силы компенсируется сопротивлением, которое жидкость оказывает на частицу. Конечный эффект «вращения» образца в центрифуге заключается в том, что массивные, мелкие и плотные частицы движутся наружу быстрее, чем менее массивные частицы или частицы с большим «сопротивлением» в жидкости. При «раскручивании» суспензии частиц в центрифуге на дне сосуда может образоваться «таблетка», обогащенная наиболее массивными частицами с малым сопротивлением жидкости.
Неуплотненные частицы остаются в основном в жидкости, называемой «надосадочной жидкостью», и могут быть удалены из сосуда, тем самым отделяя надосадочную жидкость от осадка. Скорость центрифугирования определяется угловым ускорением, приложенным к образцу, обычно измеряемым по сравнению с g . Если образцы центрифугируются достаточно долго, частицы в сосуде достигнут равновесия, при котором частицы накапливаются именно в той точке сосуда, где их плавучая плотность уравновешивается центробежной силой. Такое «равновесное» центрифугирование может обеспечить обширную очистку данной частицы.
Центрифугирование в градиенте сахарозы — линейный градиент концентрации сахара (обычно сахарозы, глицерина или среды с градиентом плотности на основе диоксида кремния, например Percoll ) — создается в пробирке таким образом, что самая высокая концентрация находится внизу, а самая низкая — вверху. Percoll — торговая марка, принадлежащая компаниям GE Healthcare. Затем образец белка наслаивают поверх градиента и вращают на высоких скоростях в ультрацентрифуге . Это заставляет тяжелые макромолекулы мигрировать ко дну трубки быстрее, чем более легкий материал. При центрифугировании в отсутствие сахарозы по мере удаления частиц от центра вращения они испытывают все большую центробежную силу (чем дальше они движутся, тем быстрее они движутся). Проблема в том, что полезный диапазон разделения внутри сосуда ограничен небольшим наблюдаемым окном. Вращение образца в два раза дольше не означает, что интересующая частица пролетит вдвое дальше; на самом деле, оно пойдет значительно дальше. Однако когда белки движутся через градиент сахарозы, они сталкиваются с жидкостью возрастающей плотности и вязкости. Правильно спроектированный градиент сахарозы будет противодействовать возрастающей центробежной силе, поэтому частицы будут двигаться точно пропорционально времени, в течение которого они находились в центробежном поле. Образцы, разделенные этими градиентами, называются «зональными» центрифугированиями. После разделения белка/частиц градиент фракционируют и собирают. В биохимии ультрацентрифугирование ценно для разделения биомолекул и анализа их физических свойств. [1]
Стратегии очистки
Выбор исходного материала является ключом к разработке процесса очистки. У растения или животного тот или иной белок обычно не распределяется по организму однородно; разные органы или ткани имеют более высокие или более низкие концентрации белка. Использование только тканей или органов с самой высокой концентрацией уменьшает объемы, необходимые для производства заданного количества очищенного белка. Если белок присутствует в небольшом количестве или имеет высокую ценность, ученые могут использовать технологию рекомбинантной ДНК для разработки клеток, которые будут производить большие количества желаемого белка (это известно как система экспрессии ). Рекомбинантная экспрессия позволяет пометить белок, например, с помощью His-метки. [5] или Strep-тег [6] для облегчения очистки, уменьшая количество необходимых стадий очистки.
Аналитическая очистка обычно использует три свойства для разделения белков. Во-первых, белки можно очистить в соответствии с их изоэлектрическими точками, пропуская их через гель с регулируемым уровнем pH или ионообменную колонку. Во-вторых, белки можно разделить в соответствии с их размером или молекулярной массой с помощью эксклюзионной хроматографии или анализа в SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Белки часто очищают с помощью 2D-PAGE , а затем анализируют с помощью дактилоскопии пептидной массы для установления идентичности белка. Это очень полезно для научных целей, поскольку пределы обнаружения белков в настоящее время очень низки, и для их анализа достаточно нанограммовых количеств белка. В-третьих, белки можно разделить по полярности/гидрофобности с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии или обращенно-фазовой хроматографии .
Обычно протокол очистки белка содержит один или несколько хроматографических этапов. Основная процедура хроматографии заключается в пропускании раствора, содержащего белок, через колонку, заполненную различными материалами. Различные белки по-разному взаимодействуют с материалом колонки и, таким образом, могут быть разделены по времени, необходимому для прохождения через колонку, или по условиям, необходимым для элюирования белка из колонки. Обычно белки обнаруживаются по мере их выхода из колонки по их поглощению при длине волны 280 нм. Существует множество различных хроматографических методов:
и дифференциальная солюбилизация Осаждение
Большинству белков требуется некоторое количество соли для растворения в воде. Этот процесс называется высаливанием. По мере увеличения концентрации соли белки могут осаждаться - процесс, называемый высаливанием, который включает в себя изменение растворимости белков. [1] Например, при массовой очистке белков обычным первым этапом выделения белков является осаждение сульфатом аммония (NH 4 ) 2 SO 4 . [7] Это осуществляется путем добавления увеличивающегося количества сульфата аммония и сбора различных фракций осажденного белка. Впоследствии сульфат аммония можно удалить с помощью диализа (отделения белков от небольших молекул через полупроницаемую мембрану). [1] На этапе осаждения сульфатом аммония гидрофобные группы, присутствующие в белках, подвергаются воздействию атмосферы, привлекая другие гидрофобные группы; в результате образуется агрегат гидрофобных компонентов. В этом случае осадок белка обычно виден невооруженным глазом . Одним из преимуществ этого метода является то, что его можно выполнить недорого даже при очень больших объемах.
Первыми очищаемыми белками являются водорастворимые белки. Очистка интегральных мембранных белков требует разрушения клеточной мембраны , чтобы изолировать какой-либо конкретный белок от других, находящихся в том же мембранном отсеке. Иногда сначала можно выделить определенную мембранную фракцию, например, изолируя митохондрии из клеток перед очисткой белка, расположенного в митохондриальной мембране. Моющее средство , такое как додецилсульфат натрия (SDS), можно использовать для растворения клеточных мембран и удержания мембранных белков в растворе во время очистки; однако, поскольку SDS вызывает денатурацию , можно использовать более мягкие детергенты, такие как Triton X-100 или CHAPS, для сохранения нативной конформации белка во время полной очистки.
фильтрационная хроматография Эксклюзивный размер (гель - )
Хроматографию можно использовать для разделения белков в растворе или в денатурирующих условиях с использованием пористых гелей. Этот метод является более избирательным разделением и известен как эксклюзионная хроматография . Принцип заключается в том, что молекулам меньшего размера приходится преодолевать больший объем пористой матрицы. Следовательно, белки определенного диапазона размеров потребуют переменного объема элюента (растворителя) перед сбором на другом конце колонки геля. Более крупные молекулы (или белки) будут проходить через меньший объем и элюироваться раньше, чем более мелкие молекулы.
В контексте очистки белка элюент обычно объединяют в разные пробирки. Все пробирки, не содержащие измеримых следов очищаемого белка, выбрасывают. Оставшийся раствор, таким образом, состоит из очищаемого белка и любых других белков аналогичного размера.
Разделение по заряду (ионообменная хроматография) [ править ]
Одного метода хроматографии, основанного на молекулярных свойствах, обычно недостаточно для получения белка высокой чистоты. [1] Помимо размера, ионообменная хроматография разделяет соединения по природе и степени их ионного заряда. Используемая колонка выбирается в зависимости от ее типа и мощности заряда. Анионообменные смолы имеют положительный заряд и используются для удержания и разделения отрицательно заряженных соединений (анионов), тогда как катионообменные смолы имеют отрицательный заряд и используются для разделения положительно заряженных молекул (катионов).
Перед началом разделения через колонку прокачивают буфер для уравновешивания противоположно заряженных ионов. При инъекции образца молекулы растворенного вещества будут обмениваться ионами буфера, поскольку каждый из них конкурирует за места связывания на смоле. Продолжительность удерживания каждого растворенного вещества зависит от силы его заряда. Первыми элюируются наиболее слабозаряженные соединения, а за ними следуют соединения с более сильным зарядом. Из-за природы механизма разделения pH, тип буфера, концентрация буфера и температура играют важную роль в контроле разделения.
Ионообменная хроматография является очень мощным инструментом для очистки белков и часто используется как при аналитическом, так и при препаративном разделении.
Свободнопоточный электрофорез [ править ]
Электрофорез в свободном потоке (FFE) — это метод электрофореза без носителя, который позволяет препаративное разделение белков в ламинарном буферном потоке с использованием ортогонального электрического поля. Используя градиент pH, который может быть вызван, например, амфолитами , этот метод позволяет разделять изоформы белка с разрешением <0,02 дельта-pI.
Разделение по гидрофобности (хроматография взаимодействия гидрофобного )
Среда HIC является амфифильной, имеет как гидрофобные, так и гидрофильные области, что позволяет разделять белки на основе гидрофобности их поверхности. Целевые белки и виды агрегатов их продуктов, как правило, имеют разные гидрофобные свойства, и их удаление с помощью HIC дополнительно очищает интересующий белок. [8] Кроме того, в используемой среде обычно используются менее жесткие условия денатурации, чем при других методах хроматографии, что помогает сохранить интересующий белок в его нативном и функциональном состоянии. В чистой воде взаимодействие между смолой и гидрофобными областями белка будет очень слабым, но это взаимодействие усиливается при нанесении образца белка на смолу HIC в буфере с высокой ионной силой. Затем ионная сила буфера снижается для элюирования белков в порядке уменьшения гидрофобности. [9]
Аффинная хроматография [ править ]
Аффинная хроматография — еще один мощный метод разделения, который обеспечивает высокую селективность в отношении интересующего белка на основе молекулярной конформации и часто использует смолы, специфичные для конкретного применения. Эти смолы имеют прикрепленные к их поверхности лиганды , специфичные для разделяемых соединений. Чаще всего эти лиганды действуют аналогично взаимодействиям антитело-антиген. Такое соответствие «замка и ключа» между лигандом и его целевым соединением делает его высокоспецифичным, часто генерируя один пик, в то время как все остальное в образце не сохраняется.
Многие мембранные белки являются гликопротеинами и могут быть очищены с помощью лектиновой аффинной хроматографии. Белкам, солюбилизированным в детергенте, можно позволить связываться с хроматографической смолой, которая была модифицирована так, чтобы иметь ковалентно присоединенный лектин. Белки, которые не связываются с лектином, смываются, а затем специфически связанные гликопротеины можно элюировать путем добавления высокой концентрации сахара, который конкурирует со связанными гликопротеинами в месте связывания лектина. Некоторые лектины обладают высокой аффинностью связывания с олигосахаридами гликопротеинов, с которыми трудно конкурировать с сахарами, и связанные гликопротеины необходимо высвобождать путем денатурации лектина.
Иммуноаффинная хроматография [ править ]
Иммуноаффинная хроматография использует специфическое связывание антитело -антиген для избирательной очистки целевого белка. Процедура включает иммобилизацию белка на твердом субстрате (например, пористом шарике или мембране), который затем избирательно связывает мишень, в то время как все остальное проходит через него. Целевой белок можно элюировать путем изменения pH или солености . Иммобилизованный лиганд может представлять собой антитело (например, иммуноглобулин G ) или белок (например, белок A ). Поскольку этот метод не требует создания метки, его можно использовать для белков из природных источников. [10]
ВЭЖХ [ править ]
Высокоэффективная жидкостная хроматография или жидкостная хроматография высокого давления — это форма хроматографии, в которой применяется высокое давление для более быстрого прохождения растворенных веществ через колонку. Это означает, что диффузия ограничена, а разрешение улучшено. Наиболее распространенной формой является «обратно-фазовая» ВЭЖХ, при которой материал колонки является гидрофобным . Белки элюируются градиентом возрастающих количеств органического растворителя , такого как ацетонитрил. Белки элюируются в зависимости от их гидрофобности. После очистки с помощью ВЭЖХ белок находится в растворе, который содержит только летучие соединения, и его легко лиофилизировать. [11] Очистка ВЭЖХ часто приводит к денатурации очищенных белков и поэтому неприменима к белкам, которые не подвергаются спонтанной рефолдингу.
Очистка меченого белка [ править ]
Другой способ пометить белки — создать на белке метку антигенного пептида, а затем очистить белок на колонке или путем инкубации с рыхлой смолой, покрытой иммобилизованным антителом . Эта конкретная процедура известна как иммунопреципитация . Иммунопреципитация способна вызвать чрезвычайно специфическое взаимодействие, которое обычно приводит к связыванию только желаемого белка. Очищенные меченые белки затем можно легко отделить от других белков в растворе, а затем элюировать обратно в чистый раствор.
Когда метки больше не нужны, их можно отщепить протеазой. Это часто включает создание сайта расщепления протеазой между меткой и белком.
Обратите внимание, что саморасщепляющаяся метка устраняет необходимость использования протеаз для отделения метки от целевого белка, представляющего интерес, в процессе очистки ( например, i CapTag™). [12] [13] Основным компонентом метки является интеин, который отщепляется просто при изменении pH. Чистый целевой белок без метки затем высвобождается в элюирующий буфер.
Концентрация очищенного белка [ править ]
В конце очистки белка его часто приходится концентрировать. Существуют разные методы.
Лиофилизация [ править ]
Если раствор не содержит других растворимых компонентов, кроме рассматриваемого белка, белок можно лиофилизировать (высушить). Обычно это делается после анализа ВЭЖХ. Это просто удаляет все летучие компоненты, оставляя белки.
Ультрафильтрация [ править ]
Ультрафильтрация концентрирует белковый раствор с помощью селективно проницаемых мембран. Функция мембраны — пропускать воду и небольшие молекулы, сохраняя при этом белок. Раствор нагнетается на мембрану с помощью механического насоса, давления газа или центрифугирования.
Оценка выхода очистки [ править ]
Самый общий метод мониторинга процесса очистки — проведение SDS-PAGE различных этапов. Этот метод дает лишь приблизительную оценку количества различных белков в смеси и не позволяет различить белки с одинаковой кажущейся молекулярной массой .
Если белок обладает отличительной спектроскопической особенностью или ферментативной активностью , это свойство можно использовать для обнаружения и количественного определения конкретного белка и, таким образом, для выбора фракций разделения, содержащих белок. Если антитела против белка доступны, то вестерн-блоттинг и ИФА могут специфически обнаружить и количественно определить количество желаемого белка. Некоторые белки действуют как рецепторы и могут быть обнаружены на этапах очистки с помощью анализа связывания лигандов , часто с использованием радиоактивного лиганда .
Чтобы оценить процесс многоступенчатой очистки, количество конкретного белка необходимо сравнить с количеством общего белка. Последний можно определить с помощью анализа общего белка по Брэдфорду или по поглощению света при 280 нм , однако некоторые реагенты, используемые в процессе очистки, могут мешать количественному определению. Например, имидазол (обычно используемый для очистки рекомбинантных белков, меченных полигистидином) является аналогом аминокислот и в низких концентрациях будет мешать анализу бицинхониновой кислоты (BCA) для количественного определения общего белка. Примеси в низкосортном имидазоле также поглощают при длине волны 280 нм, что приводит к неточным показаниям концентрации белка по УФ-поглощению.
Еще один метод, который следует рассмотреть, - это поверхностный плазмонный резонанс (ППР). SPR может обнаружить связывание молекул, не содержащих меток, на поверхности чипа. Если желаемый белок представляет собой антитело, связывание можно напрямую перевести в активность белка. Активную концентрацию белка можно выразить в процентах от общего количества белка. SPR может быть мощным методом быстрого определения активности белка и общего выхода. Это мощная технология, для работы которой требуется инструмент.
Аналитический [ править ]
Электрофорез в денатурирующих условиях [ править ]
Гель-электрофорез — распространенный лабораторный метод, который можно использовать как препаративный, так и аналитический метод. Принцип электрофореза основан на движении заряженного иона в электрическом поле. На практике белки денатурируют в растворе, содержащем детергент ( ДСН ). В этих условиях белки разворачиваются и покрываются отрицательно заряженными молекулами детергента. Белки в SDS-PAGE разделяются исключительно по их размеру.
В аналитических методах белок мигрирует в виде полос в зависимости от размера. Каждую полосу можно обнаружить с помощью красителей, таких как синий краситель Кумасси или пятно серебром . Препаративные методы очистки больших количеств белка требуют экстракции белка из электрофоретического геля. Эта экстракция может включать удаление геля, содержащего полосу, или элюирование полосы непосредственно с геля, когда она стекает с конца геля.
В контексте стратегии очистки электрофорез в денатурирующих условиях обеспечивает улучшенное разрешение по сравнению с эксклюзионной хроматографией, но не масштабируется при большом количестве белков в образце, а также на колонках для поздней хроматографии .
неденатурирующих условиях в Электрофорез
Неденатурирующий электрофоретический метод выделения биоактивных металлопротеинов в сложных белковых смесях представляет собой препаративный нативный ПААГ . Целостность или структурная целостность выделенного белка должна быть подтверждена независимым методом. [14]
См. также [ править ]
Ссылки [ править ]
- ^ Jump up to: Перейти обратно: а б с д и ж г Берг, Джереми М.; Тимочко, Джон Л.; Страйер, Люберт (2012). Биохимия (7-е изд.). Нью-Йорк: WH Freeman and Company. стр. 69–70. ISBN 978-1-4292-2936-4 .
- ^ Лабру, Невада (2021 г.). «Технологии очистки белков» . Последующая обработка белка . Методы молекулярной биологии . Том. 2178. стр. 3–10. дои : 10.1007/978-1-0716-0775-6_1 . ISBN 978-1-0716-0774-9 . ПМИД 33128738 . S2CID 226224596 .
- ^ Ван X, Хантер А.К., Мозье Н.М. (июнь 2009 г.). «Белки клеток-хозяев в разработке биологических препаратов: идентификация, количественный анализ и оценка риска» . Биотехнология и биоинженерия . 103 (3): 446–58. дои : 10.1002/бит.22304 . ПМИД 19388135 .
- ^ Сферы применения РК (1994). Очистка белка – Springer . дои : 10.1007/978-1-4757-2333-5 . ISBN 978-1-4419-2833-7 .
- ^ Спристерсбах А., Кубичек Дж., Шефер Ф., Блок Х., Мартенс Б. (2015). «Очистка белков, меченных His». Лабораторные методы в энзимологии: Белок, часть D. Методы энзимологии. Том. 559. Эльзевир. стр. 1–15. дои : 10.1016/bs.mie.2014.11.003 . ISBN 978-0-12-800279-7 . ПМИД 26096499 .
- ^ Шмидт Т.Г., Скерра А. (2007). «Система Strep-tag для одноэтапной очистки и высокоаффинного обнаружения или захвата белков». Протоколы природы . 2 (6): 1528–35. дои : 10.1038/нпрот.2007.209 . ПМИД 17571060 . S2CID 25209313 .
- ^ Вингфилд П. (май 2001 г.). «Осаждение белков сульфатом аммония» . Современные протоколы в науке о белках . Приложение 3: A.3F.1–A.3F.8. дои : 10.1002/0471140864.psa03fs13 . ISBN 978-0-471-14086-3 . ПМЦ 4817497 . ПМИД 18429073 .
- ^ МакКью, Джастин Т. (2009). Теория и использование хроматографии гидрофобного взаимодействия в приложениях по очистке белков . Методы энзимологии. Том. 463. стр. 405–414. дои : 10.1016/S0076-6879(09)63025-1 . ISBN 978-0-12-374536-1 . ISSN 1557-7988 . ПМИД 19892185 .
- ^ Кеннеди, РМ (1990). Гидрофобная хроматография . Методы энзимологии. Том. 182. стр. 339–43. дои : 10.1016/0076-6879(90)82029-2 . ISBN 978-0-12-182083-1 . ПМИД 2314246 .
- ^ Эль Х, Хорн А (1990). «Иммуноаффинная хроматография ферментов». Биосепарация . 1 (2): 97–110. ПМИД 1368167 .
- ^ Ренье Ф.Е. (октябрь 1983 г.). «Высокоэффективная жидкостная хроматография биополимеров». Наука . 222 (4621): 245–52. Бибкод : 1983Sci...222..245R . дои : 10.1126/science.6353575 . ПМИД 6353575 .
- ^ Купер, Меридет А.; Тарис, Джозеф Э.; Ши, Чанхуа; Вуд, Дэвид В. (2018). «Удобный метод метки расщепления интеина для очистки целевых белков без меток» . Современные протоколы в науке о белках . 91 (1): 5.29.1–5.29.23. дои : 10.1002/cpps.46 . ISSN 1934-3655 . ПМИД 29516483 . S2CID 3749506 .
- ^ Прабхала, Саи Вивек; Гирах, Изабела; Вуд, Дэвид В. (2022). «Эволюция методов аффинности на основе интеина, отраженная в 30-летней истории патентов» . Границы молекулярной биологии . 9 : 857566. doi : 10.3389/fmolb.2022.857566 . ISSN 2296-889X . ПМК 9033041 . ПМИД 35463948 .
- ^ Кастенхольц Б (2004). «Препаративный нативный непрерывный электрофорез в полиакриламидном геле (PNC-PAGE): эффективный метод выделения кофакторов кадмия в биологических системах». Аналитические письма . 37 (4): 657–665. дои : 10.1081/AL-120029742 . S2CID 97636537 .