Стрептококковая метка
 | Эта статья нуждается в дополнительных цитатах для проверки . ( июнь 2013 г. ) |
Система Strep-tag — это метод, который позволяет очищать и обнаруживать белки с помощью аффинной хроматографии . Strep -tag II представляет собой синтетический пептид, состоящий из восьми аминокислот ( Trp - Ser - His - Pro - Gln - Phe - Glu - Lys ). Эта пептидная последовательность проявляет внутреннее сродство к стреп-тактину, специально сконструированному стрептавидину , и может быть слита по N- или C-концу с рекомбинантными белками. Используя высокоспецифичное взаимодействие, белки, меченные Strep, можно выделить за один этап из сырых клеточных лизатов. Поскольку Strep -метка элюируется в мягких физиологических условиях, она особенно подходит для генерации функциональных белков. [1] [2]
Strep-tag, Twin-Strep-tag и Strep-Tactin являются зарегистрированными торговыми марками IBA Lifesciences GmbH .
Развитие и биохимия Strep-тега
[ редактировать ]Стрептавидин представляет собой тетрамерный белок, экспрессируемый Streptomyces avidinii . Из-за высокого сродства стрептавидина к витамину H ( биотину ), стрептавидин широко используется в области молекулярной биологии и биотехнологии . Первоначально Strep-метка была выбрана из генетической библиотеки для специфического связывания с протеолитически усеченной «основной» версией стрептавидина. На протяжении многих лет Strep-tag систематически оптимизировался, чтобы обеспечить большую гибкость в выборе места прикрепления. Кроме того, его партнер по взаимодействию, Стрептавидин, также был оптимизирован для увеличения способности связывания пептидов, что привело к разработке Стреп-Тактина. Сродство связывания Strep-tag со Strep-Tactin почти в 100 раз выше, чем Strep-tag со стрептавидином. Так называемая система Strep-tag, состоящая из Strep-tag и Strep-Tactin, оказалась особенно полезной для функционального выделения и анализа белковых комплексов в протеома . исследованиях [3]
Принцип Strep-tag
[ редактировать ]Как и другие метки с коротким сродством ( His-тег , FLAG-тег ), Strep-тег можно легко слить с рекомбинантными белками во время субклонирования его кДНК или гена . Для его экспрессии различные векторы для различных организмов-хозяев ( кишечная палочка , дрожжи , клетки насекомых и млекопитающих ). доступны [4] Особым преимуществом Strep-tag является его довольно небольшой размер и тот факт, что он биохимически почти инертен . Следовательно, на сворачивание или секрецию белка это не влияет и обычно не влияет на функцию белка. Стреп-таг особенно подходит для анализа функциональных белков, поскольку процедуру очистки можно проводить в физиологических условиях. Это позволяет не только выделять чувствительные белки в нативном состоянии, но и очищать интактные белковые комплексы. [5] даже если только одна субъединица несет метку.
На первом этапе цикла очистки Strep-tag клеточный лизат , содержащий слитый белок Strep-tag, наносится на колонку с иммобилизованным Strep-tagin (этап 1). После того как меченый белок специфически связался со стреп-тактином, короткая стадия промывания физиологическим буфером (например, фосфатно-солевым буфером, PBS) удаляет все остальные белки-хозяева (этап 2). Это связано с низкой склонностью стреп-тактина к неспецифическому связыванию белков. Затем очищенный слитый белок Strep-tag осторожно элюируется низкой концентрацией дестиобиотина , который специфически конкурирует за карман связывания биотина (этап 3). Для регенерации колонки дестиобиотин удаляют применением раствора, содержащего НАМК (желтый азокраситель ). На удаление дестиобиотина указывает изменение цвета с желто-оранжевого на красный (шаг 4+5).Наконец, раствор HABA промывают небольшим объемом рабочего буфера, тем самым подготавливая колонку к использованию для следующего цикла очистки.
Стрептококковые приложения
[ редактировать ]Система Strep-tag предлагает селективный инструмент для очистки белков в физиологических условиях. Полученные белки биоактивны и имеют очень высокую чистоту (более 95%). Также систему Strep-tag можно использовать для обнаружения белков в различных анализах. В зависимости от условий эксперимента, антитела Strep-tag или Strep-Tactin с ферментативным (например, пероксидазой хрена (HRP), щелочной фосфатазой (AP)) или флуоресцентным (например, зеленым флуоресцентным белком (GFP)) маркером. Если требуется высокая чистота, лизат можно очистить сначала с помощью Strep-Tactin, а затем выполнить второй анализ с использованием антител против Strep-tag. Это уменьшает загрязнение неспецифически связанными белками, которое может произойти в некоторых редких случаях.
Следующие анализы могут быть проведены с использованием системы обнаружения Strep-tag:
- одноэтапная аффинная очистка
- Белок: исследования взаимодействия белков
- Колониальный блот , дот-блот , вестерн-блоттинг и ИФА.
- Скрининг клонов с положительной экспрессией
- Иммуноцитохимия и иммуногистохимия
- Исследования локализации и таргетинга белков
Поскольку Strep-tag способен изолировать белковые комплексы, также можно использовать стратегии изучения белок-белковых взаимодействий. Другой вариант — иммобилизация белков Strep-tag с помощью специфических высокоаффинных антител на микропланшетах или биочипах.
Система Strep-Tag/StrepTactin также используется в для одиночных молекул оптических пинцетах и в экспериментах с атомно-силовым микроскопом , демонстрируя высокую механическую стабильность, сравнимую с самыми сильными нековалентными связями, доступными в настоящее время. [6]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Шмидт, Томас ГМ; Скерра, Арне (2007). «Система Strep-tag для одноэтапной очистки и высокоаффинного обнаружения или захвата белков». Протоколы природы . 2 (6): 1528–35. дои : 10.1038/нпрот.2007.209 . ПМИД 17571060 . S2CID 25209313 .
- ^ Скерра, А; Шмидт, Т.Г. (2000). «Использование Стрептага и стрептавидина для обнаружения и очистки рекомбинантных белков». Применение химерных генов и гибридных белков. Часть A: Экспрессия генов и очистка белков . Методы энзимологии. Том. 326. стр. 271–304. дои : 10.1016/S0076-6879(00)26060-6 . ISBN 978-0-12-182227-9 . ПМИД 11036648 .
- ^ Остермайер, Кристиан; Харренга, Аксель; Эрмлер, Ульрих; Мишель, Хартмут (1997). «Структура с разрешением 2,7 Å Paracoccus denitrificans двухсубъединичной цитохром-с-оксидазы в комплексе с фрагментом F V антитела » . Труды Национальной академии наук . 94 (20): 10547–53. дои : 10.1073/pnas.94.20.10547 . ПМК 23397 . ПМИД 9380672 .
- ^ https://www.qiagen.com/resources/download.aspx?id=0fadc040-86ad-4e31-bb58-7e83ceb77b72&lang=en [ только URL-адрес PDF ]
- ^ Хунттила, Мелисса Р.; Сааринен, Сюзанна; Шмидт, Томас; Каст, Юрген; Вестермарк, Юкка (2005). «Одностадийная очистка Strep-меток для выделения и идентификации белковых комплексов из клеток млекопитающих». Протеомика . 5 (5): 1199–203. дои : 10.1002/pmic.200400991 . ПМИД 15761952 . S2CID 24773674 .
- ^ Моайед Ф., Машаги А., Танс С.Дж. (2013)Гибрид полипептида и ДНК с возможностью селективного связывания, применяемый для наномеханических измерений одиночных молекул с использованием оптического пинцета. PLoS ONE 8(1): e54440. doi:10.1371/journal.pone.0054440 [1]