Стрептавидин
| Стрептавидин | |||
|---|---|---|---|
 Мономерный стрептавидин ( ленточная диаграмма ) со связанным биотином (сферы); ПДБ : 1СТП | |||
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | ? | ||
| ЮниПрот | P22629 | ||
| |||
Стрептавидин / ˌ s t r ɛ p ˈ t æ v ɪ d ɪ n / массой 52 кДа представляет собой белок (тетрамер), очищенный из бактерии Streptomyces avidinii . стрептавидина Гомо-тетрамеры обладают чрезвычайно высоким сродством к биотину (также известному как витамин B7 или витамин H). С константой диссоциации (K d ) порядка ≈10 −14 Молл, [1] связывание биотина со стрептавидином является одним из самых сильных нековалентных взаимодействий, известных в природе. Стрептавидин широко используется в молекулярной биологии и бионанотехнологии из-за устойчивости комплекса стрептавидин-биотин к органическим растворителям, денатурантам (например, хлориду гуанидина ), детергентам (например, SDS , Triton X-100 ), протеолитическим ферментам, а также экстремальным температурам и pH.
Структура
[ редактировать ]
О кристаллической структуре стрептавидина со связанным биотином сообщили две группы в 1989 году. Структура была расшифрована с использованием многоволновой аномальной дифракции Hendrickson et al. [2] в Колумбийском университете и с использованием множественной изоморфной замены Weber et al. [3] в Центральном отделе исследований и разработок EI DuPont. депонирована 171 структура По состоянию на сентябрь 2017 года в Банке данных белков . смотрите по этой ссылке Полный список . N- и C-концы полноразмерного белка, состоящего из 159 остатков, обрабатываются с образованием более короткого «ядерного» стрептавидина, обычно состоящего из остатков 13–139; удаление N- и C-концев необходимо для достижения наивысшего сродства к биотин-связыванию. Вторичная структура мономера стрептавидина состоит из восьми антипараллельных β-цепей, которые складываются, образуя антипараллельную третичную структуру β-цилиндра . Сайт связывания биотина расположен на одном конце каждого β-цилиндра. Четыре идентичных мономера стрептавидина (т.е. четыре идентичных β-цилиндра) соединяются, образуя тетрамерную четвертичную структуру стрептавидина. Сайт связывания биотина в каждом стволе состоит из остатков из внутренней части ствола вместе с консервативным Trp120 из соседней субъединицы. Таким образом, каждая субъединица вносит свой вклад в сайт связывания соседней субъединицы, и поэтому тетрамер также можно рассматривать как димер функциональных димеров.
Истоки высокой близости
[ редактировать ]Многочисленные кристаллические структуры комплекса стрептавидин-биотин пролили свет на происхождение удивительного сродства. Во-первых, существует высокая комплементарность формы между связывающим карманом и биотином. Во-вторых, существует обширная сеть водородных связей, образующихся с биотином в месте связывания. Существует восемь водородных связей, непосредственно образующихся с остатками в сайте связывания (так называемая «первая оболочка» водородной связи), включая остатки Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 и Asp128. Существует также «вторая оболочка» водородной связи, включающая остатки, которые взаимодействуют с остатками первой оболочки. Однако сродство стрептавидин-биотин превышает то, которое можно было бы предсказать только на основе взаимодействий водородных связей, что указывает на другой механизм, способствующий высокому сродству. [4] Карман, связывающий биотин, является гидрофобным , и существуют многочисленные контакты, опосредованные силой Ван-дер-Ваальса, и гидрофобные взаимодействия, возникающие с биотином, когда он находится в кармане, что также считается причиной высокого сродства. В частности, карман выстлан консервативными остатками триптофана. Наконец, связывание биотина сопровождается стабилизацией гибкой петли, соединяющей β-цепи 3 и 4 (L3/4), которая закрывается над связанным биотином, действуя как «крышка» над связывающим карманом и способствуя чрезвычайно медленному высвобождению биотина. скорость диссоциации.
Большинство попыток мутировать стрептавидин приводят к снижению аффинности связывания биотина, чего и следовало ожидать в такой высокооптимизированной системе. Однако было обнаружено, что недавно созданный мутант стрептавидина, названный траптавидином, имеет более чем в десять раз более медленную диссоциацию биотина, а также более высокую термическую и механическую стабильность. [5] Это снижение скорости диссоциации сопровождалось двукратным снижением скорости ассоциации.
Сродство связывания биотина может быть нарушено химическим мечением стрептавидина, например, аминореактивными флуорофорами ; флавидин представляет собой мутант стрептавидина без боковых цепей лизина, который сохраняет хорошие характеристики связывания биотина после такого мечения флуоресцентным красителем, при котором краситель соединяется с аминоконцом. [6]
Использование в биотехнологии
[ редактировать ]Среди наиболее распространенных применений стрептавидина — очистка или обнаружение различных биомолекул. Сильное взаимодействие стрептавидин-биотин можно использовать для прикрепления различных биомолекул друг к другу или к твердой основе. Для разрыва взаимодействия стрептавидин-биотин, которое часто денатурирует очищаемый интересующий белок, необходимы суровые условия. Однако было показано, что короткая инкубация в воде при температуре выше 70 ° C обратимо разорвет взаимодействие (по крайней мере, для биотинилированной ДНК) без денатурации стрептавидина, что позволяет повторно использовать твердую подложку стрептавидина. [7] Еще одним применением стрептавидина является очистка и обнаружение белков, генетически модифицированных пептидом Strep-tag . Стрептавидин широко используется в вестерн-блоттинге и иммуноанализах в сочетании с некоторыми репортерными молекулами, такими как пероксидаза хрена .Стрептавидин также использовался в развивающейся области нанобиотехнологии , использовании биологических молекул, таких как белки или липиды, для создания наноразмерных устройств/структур. В этом контексте стрептавидин можно использовать в качестве строительного блока для связывания биотинилированных молекул ДНК с целью создания из одностенных углеродных нанотрубок. каркасов [8] или даже сложные полиэдры ДНК. [9] Тетрамерный стрептавидин также использовался в качестве узла, вокруг которого могут быть расположены другие белки, либо с помощью аффинной метки, такой как Strep-tag или AviTag , либо путем генетического слияния со SpyTag . [10] Слияние со SpyTag позволило генерировать сборки с 8 или 20 субъединицами стрептавидина. А также зонд молекулярной силы для атомно-силовой микроскопии , исследований [11] новые материалы, такие как трехмерные кристаллические решетки [12] также были созданы. Стрептавидин имеет слегка кислую изоэлектрическую точку (pI) ~5, но также коммерчески доступна рекомбинантная форма стрептавидина с почти нейтральной изоэлектрической точкой.
- Претаргетная иммунотерапия
Предварительно таргетная иммунотерапия использует стрептавидин, конъюгированный с моноклональным антителом против антигенов, специфичных для раковых клеток, с последующей инъекцией меченного радиоактивным изотопом биотина для доставки радиации только к раковой клетке. Первоначальные препятствия включают насыщение участков связывания биотина на стрептавидине эндогенным биотином вместо введенного радиоактивно меченного биотина, а также высокую степень радиоактивного воздействия на почки из-за сильных адсорбционных свойств стрептавидина в клетках. В настоящее время считается, что такой высокий уровень связывания с прикрепленными типами клеток, такими как активированные тромбоциты и меланомы, является результатом связывания интегрина, опосредованного последовательностью RYD в стрептавидине. [13]
Варианты с контролируемым количеством сайтов связывания.
[ редактировать ]- Моновалентный против мономерного
Стрептавидин представляет собой тетрамер, и каждая субъединица связывает биотин с одинаковым сродством. Мультивалентность является преимуществом в таких приложениях, как окрашивание тетрамеров MHC , где эффекты авидности улучшают способность молекул MHC, прикрепленных к стрептавидину, обнаруживать специфические Т-клетки. [14] В других случаях, например, при использовании стрептавидина для визуализации специфических белков в клетках, мультивалентность может нарушать функцию интересующего белка. Моновалентный стрептавидин представляет собой сконструированную рекомбинантную форму стрептавидина, которая представляет собой тетрамер, но только один из четырех сайтов связывания является функциональным. Этот единственный сайт связывания имеет 10 −14 моль/л сродства и не может вызвать сшивку. [15] Применение моновалентного стрептавидина включало флуоресцентное отслеживание рецепторов клеточной поверхности , украшение ДНК-оригами и работу в качестве указателя для идентификации конкретных областей для криоэлектронной микроскопии .
Мономерный стрептавидин представляет собой рекомбинантную форму стрептавидина с мутациями, позволяющими расщепить тетрамер на мономер и повысить растворимость полученной изолированной субъединицы. Мономерные версии стрептавидина имеют сродство к биотину 10. −7 моль/л 10 −8 моль/л и поэтому не идеальны для мечения, но полезны для очистки, где желательна обратимость. [16] [17]
- двухвалентный
Стрептавидин, имеющий ровно два сайта связывания биотина на тетрамер, может быть получен путем смешивания субъединиц с функциональным сайтом связывания биотина и без него и очистки с помощью ионообменной хроматографии . Функциональные сайты связывания здесь имеют такую же стабильность связывания биотина, как и стрептавидин дикого типа. Двухвалентный стрептавидин с двумя сайтами связывания биотина вместе (цис-дивалент) или порознь (транс-дивалент) может быть очищен отдельно. [18]
- Трехвалентный
Стрептавидин, имеющий ровно три сайта связывания биотина на тетрамер, также можно получить, используя тот же принцип, что и для получения двухвалентных стрептавидинов. [19]
- Высоковалентные стрептавидины
получены стрептавидины более высокой валентности С помощью химии конъюгации изопептидных связей с использованием технологии SpyTag/SpyCatcher . [20] Это предполагает наличие тетрамера стрептавидина с тремя сайтами связывания биотина и мертвого стрептавидина, слитого либо со SpyTag, либо со SpyCatcher. Когда различные тетрамеры смешиваются вместе, возникает ковалентная связь, обеспечивающая большее количество сайтов связывания биотина. С помощью этого метода были созданы шесть и двенадцать сайтов связывания биотина на молекулу.
Сравнение с авидином
[ редактировать ]Стрептавидин — не единственный белок, способный связываться с биотином с высоким сродством. Авидин — еще один наиболее известный биотинсвязывающий белок. Первоначально выделенный из яичного желтка, авидин имеет лишь 30% идентичности последовательности со стрептавидином, но почти идентичную вторичную, третичную и четвертичную структуру. Авидин имеет более высокое сродство к биотину ( К д ~ 10 −15 М), но в отличие от стрептавидина авидин гликозилирован, положительно заряжен, обладает псевдокаталитической активностью (авидин может усиливать щелочной гидролиз сложноэфирной связи между биотином и нитрофенильной группой) и обладает более высокой склонностью к агрегации. С другой стороны, стрептавидин является лучшим связующим веществом конъюгата биотина; авидин имеет более низкую аффинность связывания, чем стрептавидин, когда биотин конъюгирован с другой молекулой, несмотря на то, что авидин имеет более высокое сродство к свободному, неконъюгированному биотину. Поскольку стрептавидин не содержит каких-либо модификаций углеводов и имеет почти нейтральный pI , его преимуществом является гораздо более низкое неспецифическое связывание, чем у авидина. Дегликозилированный авидин (НейтрАвидин) более сопоставим по размеру, pI и неспецифическому связыванию со стрептавидином.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Грин, Нью-Мексико (1975). «Авидин». Достижения в области химии белков . 29 : 85–133. дои : 10.1016/s0065-3233(08)60411-8 . ISBN 9780120342297 . ПМИД 237414 .
- ^ Хендриксон В.А., Пэлер А., Смит Дж.Л., Сатоу Ю., Мерритт Э.А., Физакерли Р.П. (апрель 1989 г.). «Кристаллическая структура основного стрептавидина, определенная методом многоволновой аномальной дифракции синхротронного излучения» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 86 (7): 2190–4. дои : 10.1073/pnas.86.7.2190 . ПМК 286877 . ПМИД 2928324 .
- ^ Вебер ПК, Олендорф Д.Х., Вендолоски Дж.Дж., Салем, Франция (январь 1989 г.). «Структурные причины высокоаффинного связывания биотина со стрептавидином». Наука . 243 (4887): 85–8. дои : 10.1126/science.2911722 . ПМИД 2911722 .
- ^ ДеЧанси Дж., Хоук К.Н. (май 2007 г.). «Истоки фемтомолярного связывания белка с лигандом: кооперативность водородных связей и энергетика десольватации в месте связывания биотин-(стрепт)авидин» . Журнал Американского химического общества . 129 (17): 5419–29. дои : 10.1021/ja066950n . ПМК 2527462 . ПМИД 17417839 .
- ^ Чиверс С.Э., Кроза Э., Чу С., Мой В.Т., Шерратт Д.Д., Ховарт М. (май 2010 г.). «Вариант стрептавидина с более медленной диссоциацией биотина и повышенной механостабильностью» . Природные методы . 7 (5): 391–3. дои : 10.1038/nmeth.1450 . ПМЦ 2862113 . ПМИД 20383133 .
- ^ Якобсен М.Т., Фэйрхед М., Фогельстранд П., Ховарт М. (август 2017 г.). «Аминный ландшафт для максимизации флуоресценции белка и красителя и ультрастабильного взаимодействия белка и лиганда» . Клеточная химическая биология . 24 (8): 1040–1047.e4. doi : 10.1016/j.chembiol.2017.06.015 . ПМК 5563079 . ПМИД 28757182 .
- ^ Хольмберг А., Бломстергрен А., Норд О., Лукач М., Лундеберг Дж., Улен М. (февраль 2005 г.). «Взаимодействие биотина и стрептавидина можно обратимо разорвать с помощью воды при повышенных температурах». Электрофорез . 26 (3): 501–10. дои : 10.1002/elps.200410070 . ПМИД 15690449 . S2CID 16058388 .
- ^ Остоич Г.Н., Hersam MC (июнь 2012 г.). «Биомолекулярная сборка самонесущих, нанопористых, проводящих и люминесцентных каркасов из одностенных углеродных нанотрубок». Маленький . 8 (12): 1840–5. дои : 10.1002/smll.201102536 . ПМИД 22461319 .
- ^ Чжан С, Тянь С, Го Ф, Лю Цз, Цзян В, Мао С (апрель 2012 г.). «Трехмерная организация белка, управляемая ДНК». Ангеванде Хеми . 51 (14): 3382–5. дои : 10.1002/anie.201108710 . ПМИД 22374892 .
- ^ Фэйрхед М., Веджиани Г., Левер М., Ян Дж., Меснер Д., Робинсон К.В., Душек О., ван дер Мерве П.А., Ховарт М. (сентябрь 2014 г.). «Концентраторы SpyAvidin обеспечивают точную и сверхстабильную ортогональную наносборку» . Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12355–63. дои : 10.1021/ja505584f . ПМК 4183622 . ПМИД 25111182 .
- ^ Ким М., Ван CC, Бенедетти Ф., Марсалек П.Е. (февраль 2012 г.). «Наноразмерный силовой зонд для измерения межмолекулярных взаимодействий» . Ангеванде Хеми . 51 (8): 1903–6. дои : 10.1002/anie.201107210 . ПМК 3279624 . ПМИД 22253141 .
- ^ Синклер Дж. К., Дэвис К. М., Веньен-Брайан С., Нобл М. Е. (июль 2011 г.). «Генерация белковых решеток путем слияния белков с соответствующей вращательной симметрией». Природные нанотехнологии . 6 (9): 558–62. дои : 10.1038/nnano.2011.122 . ПМИД 21804552 .
- ^ Алон Р., Байер Э.А., Вилчек М. (август 1992 г.). «Клеточно-адгезивные свойства стрептавидина опосредуются воздействием RGD-подобного сайта RYD». Европейский журнал клеточной биологии . 58 (2): 271–9. ПМИД 1425765 .
- ^ Сюй XN, Скритон Г.Р. (октябрь 2002 г.). «Исследование функции Т-клеток на основе MHC / пептидного тетрамера». Журнал иммунологических методов . 268 (1): 21–8. дои : 10.1016/S0022-1759(02)00196-5 . ПМИД 12213339 .
- ^ Ховарт М., Чиннапен DJ, Герроу К., Доррестейн ПК, Гранди М.Р., Келлехер Н.Л., Эль-Хусейни А., Тинг А.Ю. (апрель 2006 г.). «Моновалентный стрептавидин с одним фемтомолярным сайтом связывания биотина» . Природные методы . 3 (4): 267–73. дои : 10.1038/nmeth861 . ПМК 2576293 . ПМИД 16554831 .
- ^ Ву С.К., Вонг С.Л. (июнь 2005 г.). «Разработка растворимого мономерного стрептавидина с обратимой способностью связывать биотин» . Журнал биологической химии . 280 (24): 23225–31. дои : 10.1074/jbc.M501733200 . ПМИД 15840576 .
- ^ Лим К.Х., Хуан Х., Пралле А., Парк С. (октябрь 2011 г.). «Инженерный мономер и димер стрептавидина с улучшенной стабильностью и функцией». Биохимия . 50 (40): 8682–91. дои : 10.1021/bi2010366 . ПМИД 21892837 .
- ^ Фэйрхед М., Крндиджа Д., Лоу Э.Д., Ховарт М. (январь 2014 г.). «Сопряжение по принципу «подключи и работай» с помощью определенных двухвалентных стрептавидинов» . Журнал молекулярной биологии . 426 (1): 199–214. дои : 10.1016/j.jmb.2013.09.016 . ПМК 4047826 . ПМИД 24056174 .
- ^ Дубачева Галина Владимировна; Арайя-Каллис, Каролина; Герт Волбеда, Энн; Фэрхед, Майкл; Коди, Жерун; Ховарт, Марк; Рихтер, Ральф П. (9 марта 2017 г.). «Контроль мультивалентного связывания посредством химии поверхности: модельное исследование стрептавидина» . Журнал Американского химического общества . 139 (11): 4157–4167. дои : 10.1021/jacs.7b00540 . ПМК 5364436 . ПМИД 28234007 .
- ^ Фэрхед, Майкл; Веджиани, Джанлука; Левер, Мелисса; Ян, Джун; Меснер, Деян; Робинсон, Кэрол В.; Душек, Омер; ван дер Мерве, П. Антон; Ховарт, Марк (21 августа 2014 г.). «Концентраторы SpyAvidin обеспечивают точную и сверхстабильную ортогональную наносборку» . Журнал Американского химического общества . 136 (35): 12355–12363. дои : 10.1021/ja505584f . ПМК 4183622 . ПМИД 25111182 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Хатченс Т.В., Порат Дж.О. (сентябрь 1987 г.). «Распознавание белком иммобилизованных лигандов: содействие селективной адсорбции» . Клиническая химия . 33 (9): 1502–8. дои : 10.1093/клинчем/33.9.1502 . ПМИД 3621554 .
- Ходош Л.А., Буратовский С (2001). «Очистка ДНК-связывающих белков с использованием аффинных систем биотин/стрептавидин». Современные протоколы в науке о белках . Том. Глава 9. 9.7.1–9.7.13. дои : 10.1002/0471140864.ps0907s12 . ISBN 978-0-471-14086-3 . ПМИД 18429216 . S2CID 23660759 .
- Циммерманн Р.М., Кокс EC (февраль 1994 г.). «Растяжение ДНК на функционализированных золотых поверхностях» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (3): 492–7. дои : 10.1093/нар/22.3.492 . ПМК 523609 . ПМИД 8127690 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Запись Swiss-Prot на предшественник стрептавидина из Streptomyces avidinii
- Стрептавидин в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)
- Чрезвычайно полезное взаимодействие с яйцом. Довольно интересная статья о структуре PDB на PDBe.
Группы, исследующие и разрабатывающие белки семейства стрептавидина или авидина (в алфавитном порядке)