Тетрамерный анализ
| Тетрамерный анализ | |
|---|---|
| Синонимы | Пятно тетрамера |
| Цель | использует тетрамерные белки для обнаружения и количественного определения Т-клеток |
Тетрамерный анализ (также известный как тетрамерное окрашивание ) — это процедура, в которой используются тетрамерные белки для обнаружения и количественного определения Т-клеток , специфичных для данного антигена в образце крови. [ 1 ] Тетрамеры, используемые в анализе, состоят из четырех молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC), которые находятся на поверхности большинства клеток организма. [ 2 ] Молекулы MHC представляют пептиды Т-клеткам, чтобы сообщить о присутствии вирусов, бактерий, раковых мутаций или других антигенов в клетке. Если рецептор Т-клетки соответствует пептиду, представленному молекулой MHC, запускается иммунный ответ. [ 3 ] Таким образом, тетрамеры MHC, биоинженерные для презентации конкретного пептида, можно использовать для поиска Т-клеток с рецепторами, соответствующими этому пептиду. Тетрамеры помечены флуорофором , что позволяет анализировать Т-клетки, связанные с тетрамерами, с помощью проточной цитометрии . [ 4 ] Количественное определение и сортировка Т-клеток с помощью проточной цитометрии позволяет исследователям исследовать иммунный ответ на вирусную инфекцию и введение вакцины, а также функциональность антигенспецифических Т-клеток. [ 5 ] человека Как правило, если иммунная система столкнулась с патогеном , у человека будут Т-клетки, специфичные к некоторому пептиду этого патогена. Следовательно, если окрашивание тетрамером, специфичным для патогенного пептида, дает положительный сигнал, это может указывать на то, что иммунная система человека столкнулась с этим патогеном и выработала ответ на него. [ нужна ссылка ]
История
[ редактировать ]Эта методология была впервые опубликована в 1996 году лабораторией Стэнфордского университета. [ 6 ] Предыдущие попытки количественного определения антигенспецифических Т-клеток включали менее точный анализ предельного разведения, который оценивал количество Т-клеток в 50-500 раз ниже их фактического уровня. [ 7 ] [ 8 ] Окрашивание с использованием растворимых мономеров MHC также оказалось безуспешным из-за низкой аффинности связывания рецепторов Т-клеток и мономеров MHC-пептида. Тетрамеры MHC могут связываться более чем с одним рецептором на Т-клетке-мишени, что приводит к увеличению общей силы связывания и снижению скорости диссоциации. [ 5 ]
Использование
[ редактировать ]CD8+ Т-клетки
[ редактировать ]Окрашивание тетрамером обычно анализирует популяции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL). [ 9 ] ЦТЛ также называют CD8+ Т-клетками, поскольку они имеют CD8 корецепторы , которые связываются с молекулами MHC класса I. Большинство клеток в организме экспрессируют молекулы MHC класса I, которые отвечают за обработку внутриклеточных антигенов и представление их на поверхности клетки. Если пептиды, представленные молекулами MHC класса I, являются чужеродными (например, полученными из вирусных белков, а не из собственных белков клетки), CTL с рецептором, соответствующим пептиду, разрушит клетку. [ 2 ] [ 3 ] Окрашивание тетрамером позволяет визуализировать, количественно оценить и сортировать эти клетки с помощью проточной цитометрии, что чрезвычайно полезно в иммунологии . Популяции Т-клеток можно отслеживать на протяжении всего периода существования вируса или после применения вакцины. Окрашивание тетрамером также можно сочетать с функциональными анализами, такими как ELIspot , который определяет количество клеток, секретирующих цитокины, в образце. [ 9 ]
Конструкция тетрамера MHC класса I
[ редактировать ]
Молекулы тетрамера MHC, разработанные в лаборатории, могут имитировать антигенпрезентирующий комплекс на клетках и связываться с Т-клетками, которые распознают антиген. Молекулы MHC класса I состоят из полиморфной тяжелой α-цепи, связанной с инвариантным микроглобулином бета-2 легкой цепи (β2m). Escherichia coli используется для синтеза легкой цепи и укороченной версии тяжелой цепи, которая включает биотина метку распознавания аминокислот . Эти цепи MHC биотинилируются ферментом BirA и повторно сворачиваются с помощью интересующего антигенного пептида. Биотин представляет собой небольшую молекулу, которая образует прочную связь с другим белком, называемым стрептавидином. Стрептавидин, меченный флуорофором, добавляется к биоинженерным мономерам MHC, и взаимодействие биотин-стрептавидин заставляет четыре мономера MHC связываться со стрептавидином и создавать тетрамер. Когда тетрамеры смешиваются с образцом крови, они связываются с Т-клетками, экспрессирующими соответствующий антиген-специфичный рецептор. Любые несвязанные тетрамеры MHC вымываются из образца перед его анализом с помощью проточной цитометрии. [ 9 ]
Недавние достижения в области рекомбинантных молекул MHC демократизировали формулировку пептидного комплекса MHC и последующую мультимеризацию. Высокоактивные составы широкого спектра молекул MHC класса I. [ 10 ] теперь позволяет пользователям, не являющимся экспертами, ежедневно создавать свои собственные комплексы пептид-MHC в любой лаборатории без специального оборудования. [ нужна ссылка ]
CD4+ Т-клетки
[ редактировать ]Также были разработаны тетрамеры, которые связываются с Т-хелперами. [ 9 ] Т-хелперы или CD4+ Т-клетки экспрессируют CD4 корецепторы . Они связываются с молекулами MHC класса II , которые экспрессируются только в профессиональных антигенпрезентирующих клетках, таких как дендритные клетки или макрофаги . Молекулы MHC класса II представляют внеклеточные антигены, позволяя Т-хелперам обнаруживать бактерии. [ 11 ] грибки и паразиты. [ 2 ] Использование тетрамеров MHC класса II становится все более распространенным, но тетрамеры сложнее создать, чем тетрамеры класса I, а связь между Т-хелперами и молекулами MHC еще слабее. [ 9 ] [ 12 ]
Естественные Т-клетки-киллеры
[ редактировать ]Естественные Т-киллеры (NKT-клетки) также можно визуализировать с помощью тетрамерной технологии. NKT-клетки связываются с белками, которые представляют липидные или гликолипидные антигены. [ 13 ] Антигенпрезентирующий комплекс, с которым связываются NKT-клетки, включает белки CD1 , поэтому тетрамеры, состоящие из CD1, можно использовать для окрашивания NKT-клеток. [ 9 ]
Примеры
[ редактировать ]Раннее применение технологии тетрамеров было сосредоточено на клеточном иммунном ответе на ВИЧ- инфекцию. Тетрамеры MHC были разработаны для презентации антигенов ВИЧ и использовались для определения процента CTL, специфичных к этим антигенам ВИЧ, в образцах крови инфицированных пациентов. Это сравнивали с результатами цитотоксических анализов и вирусной нагрузки РНК плазмы , чтобы охарактеризовать функцию CTL при ВИЧ-инфекции. ЦТЛ, связавшиеся с тетрамерами, сортировали в лунки ELIspot для анализа секреции цитокинов. [ 14 ]
В другом исследовании тетрамерные комплексы MHC использовались для изучения эффективности метода доставки вакцины против гриппа . Мышам делали подкожную и интраназальную вакцинацию против гриппа, а окрашивание тетрамерами в сочетании с проточной цитометрией использовали для количественного определения CTL, специфичных к антигену, используемому в вакцине. Это позволило сравнить иммунный ответ (количество Т-клеток, нацеленных на вирус) при двух разных методах доставки вакцины. [ 15 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Руководство по окрашиванию тетрамера» . Mblintl.com . 2019.
- ^ Перейти обратно: а б с «Большой комплекс гистосовместимости» . ИнтерПро . Европейский институт биоинформатики (EMBL-EBI) . Проверено 2 декабря 2018 г.
- ^ Перейти обратно: а б «Адаптивный иммунный ответ: Т-лимфоциты и их функциональные типы» . Анатомия и физиология II . Люмен Обучение . Проверено 2 декабря 2018 г.
- ^ «Тетрамеры MHC» . ООО «Медицинские и биологические лаборатории» (MBL) . Проверено 2 декабря 2018 г.
- ^ Перейти обратно: а б «Технология тетрамера MHC — примечание 7.2» . Термо Фишер Сайентифик . Проверено 2 декабря 2018 г.
- ^ Альтман Дж.Д., Мосс П.А., Гулдер П.Дж., Баруш Д.Х., Макхейзер-Уильямс М.Г., Белл Дж.И., МакМайкл А.Дж., Дэвис М.М. (июль 2011 г.). «Фенотипический анализ антигенспецифических Т-лимфоцитов. Наука. 1996. 274: 94-96». Журнал иммунологии . 187 (1): 7–9. JSTOR 2891862 . ПМИД 21690331 .
- ^ Кимбалл Дж.В. «Анализ предельного разбавления» . Страницы биологии Кимбалла . Фонд Сэйлора . Проверено 2 декабря 2018 г.
- ^ МакМайкл А.Дж., О'Каллаган, Калифорния (май 1998 г.). «Новый взгляд на Т-клетки» . Журнал экспериментальной медицины . 187 (9): 1367–71. дои : 10.1084/jem.187.9.1367 . ПМК 2212275 . ПМИД 9565629 .
- ^ Перейти обратно: а б с д и ж Симс С., Уиллберг С., Кленерман П. (июль 2010 г.). «Тетрамеры MHC-пептида для анализа антигенспецифических Т-клеток». Экспертная оценка вакцин . 9 (7): 765–74. дои : 10.1586/erv.10.66 . ПМИД 20624049 . S2CID 20822684 .
- ^ «Сделай сам - Тетрамеры MHC класса I» . immunAware.com . 2019.
- ^ Моннот Г.К., Вегреки М, Ченг Т.Ю., Чен Ю.Л., Салли Б.Н., Чакраварти Р., Каранца И.М., Тин С.Ю., Халил А.Е., Монга И., Увакве Л.Н., Тиллман А., Ченг Б., Юсеф С., Нг С.В., Шахин А., Гарсия- [ В PubMed ] Вилас Дж.А., Улеманн AC, Бордоне Л.А., Хан А., Роде CH, Огг Дж., Муди Д.Б., Россджон Дж., де Йонг А. (январь 2023 г.). «Стафилококковые фосфатидилглицериновые антигены активируют Т-клетки человека через CD1a» . Природная иммунология . 24 (1): 110–122. дои : 10.1038/s41590-022-01375-z . ПМЦ 10389259 . ПМИД 35265979 . S2CID 255039948 .
- ^ Джеймс Э.А., ЛаФонд Р., Дуринович-Белло I, Квок В. (март 2009 г.). «Визуализация антигенспецифических CD4+ Т-клеток с использованием тетрамеров MHC класса II» . Журнал визуализированных экспериментов (25). дои : 10.3791/1167 . ПМК 2789100 . ПМИД 19270641 .
- ^ Шекхар С., Джойи А.Г., Ян Икс (2014). «Инвариантные естественные Т-киллеры Т-клетки: благо или вред для иммунитета к внутриклеточным бактериальным инфекциям?» . Журнал врожденного иммунитета . 6 (5): 575–84. дои : 10.1159/000361048 . ПМК 6741619 . ПМИД 24903638 .
- ^ Огг Г.С., Джин Х, Бонхёффер С., Данбар П.Р., Новак М.А., Монард С., Сигал Дж.П., Цао Ю, Роуленд-Джонс С.Л., Серундоло В., Херли А., Марковиц М., Хо Д.Д., Никсон Д.Ф., МакМайкл А.Дж. (март 1998 г.) . «Количественное определение ВИЧ-1-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов и нагрузки вирусной РНК в плазме» . Наука . 279 (5359): 2103–6. Бибкод : 1998Sci...279.2103O . дои : 10.1126/science.279.5359.2103 . ПМИД 9516110 .
- ^ Си Ю, Вэнь Ю, Келли Ш., Чонг А. С., Кольер Дж. Х. (июль 2018 г.). «+ Т-клеточные ответы» . Журнал контролируемого выпуска . 282 : 120–130. дои : 10.1016/j.jconrel.2018.04.031 . ПМК 6309200 . ПМИД 29673645 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Альтман Дж.Д., Мосс П.А., Гулдер П.Дж., Баруш Д.Х., Макхейзер-Уильямс М.Г., Белл Дж.И., МакМайкл А.Дж., Дэвис М.М. (октябрь 1996 г.). «Фенотипический анализ антигенспецифических Т-лимфоцитов». Наука . 274 (5284): 94–6. Бибкод : 1996Sci...274...94A . дои : 10.1126/science.274.5284.94 . ПМИД 8810254 . S2CID 12667633 .