FLAG-тег
FLAG-тег , или октапептид FLAG , или эпитоп FLAG , представляет собой пептидную белковую метку , которую можно добавить к белку с использованием рекомбинантной ДНК технологии , имеющую последовательность DYKDDDDK (где D = аспарагиновая кислота , Y = тирозин и K = лизин ). [ 1 ] Это один из самых специфических тегов [ 2 ] и это искусственный антиген, к которому были разработаны специфические моноклональные антитела с высоким сродством, и, следовательно, его можно использовать для очистки белков с помощью аффинной хроматографии , а также для обнаружения белков внутри живых клеток. FLAG-метка использовалась для отделения рекомбинантного сверхэкспрессированного белка от белка дикого типа, экспрессируемого организмом-хозяином. FLAG-tag также можно использовать для выделения белковых комплексов с множеством субъединиц, поскольку мягкая процедура очистки FLAG-tag не разрушает такие комплексы. Очистка на основе FLAG-тегов использовалась для получения белков достаточной чистоты и качества для определения трехмерной структуры методом рентгеновской кристаллографии .
FLAG-тег можно использовать во многих различных анализах , требующих распознавания антителом . Если антитела против данного белка нет, добавление метки FLAG к белку позволяет изучить белок с помощью антитела против последовательности метки FLAG. Примерами являются исследования клеточной локализации с помощью иммунофлуоресценции , иммунопреципитации или обнаружения с помощью электрофореза белков в SDS PAGE и вестерн-блоттинга .
Пептидная последовательность FLAG-метки от N-конца до С-конца: DYKDDDDK (1012 Да). Кроме того, в тандеме можно использовать FLAG-метки, обычно пептид 3xFLAG: DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK (с последней меткой, кодирующей сайт расщепления энтерокиназой). FLAG-метка может быть слита с С-концом или N-концом белка или вставлена внутрь белка. Некоторые коммерчески доступные антитела (например, M1/4E11) распознают эпитоп только тогда, когда FLAG-метка присутствует на N-конце. Однако другие доступные антитела (например, М2) нечувствительны к положению. Остаток тирозина в FLAG-метке может сульфатироваться при экспрессии на определенных секретируемых белках, что может влиять на распознавание антителами эпитопа FLAG. [ 3 ] FLAG-тег можно использовать в сочетании с другими аффинными тегами, например полигистидиновым тегом ( His-tag ), HA-тегом или myc-тегом .
История
[ редактировать ]Первое использование мечения эпитопов было описано Манро и Пелхэмом в 1984 году. [ 4 ] FLAG-тег стал вторым примером полностью функциональной улучшенной эпитопной метки, опубликованным в научной литературе. [ 1 ] [ 5 ] [ 6 ] и был единственной запатентованной эпитопной меткой. [ 7 ] [ 8 ] С тех пор он стал одной из наиболее часто используемых белковых меток в лабораториях по всему миру. В отличие от некоторых других меток (например, myc, HA), где моноклональное антитело сначала выделяли против существующего белка, затем эпитоп охарактеризовывали и использовали в качестве метки, эпитоп FLAG представлял собой идеализированную искусственную конструкцию, к которой были созданы моноклональные антитела. . Последовательность FLAG-метки была оптимизирована для совместимости с белками, к которым она прикреплена, поскольку FLAG-метка более гидрофильна, чем другие распространенные эпитопные метки, и, следовательно, с меньшей вероятностью снижает активность белков, к которым присоединена FLAG-метка. Кроме того, N-концевые метки FLAG можно легко удалить из белков после их выделения путем обработки специфической протеазой энтерокиназой ( энтеропептидазой ).
Третий отчет о мечении эпитопа ( HA-tag ), [ 9 ] появился примерно через год после первой поставки системы Flag.
См. также
[ редактировать ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б Хопп Т.П., Прикетт К.С., Прайс В.Л., Либби РТ, Марч СиДжей, Пэт Серретти Д., Урдал Д.Л., Конлон П.Дж. (1988). «Короткая маркерная последовательность полипептида, полезная для идентификации и очистки рекомбинантных белков». Био/Технологии . 6 (10): 1204–10. дои : 10.1038/nbt1088-1204 . S2CID 205272216 .
- ^ «Куб Биотех» . Куб Биотех . Проверено 13 февраля 2020 г.
- ^ Хантер М.Р., Гримси Н.Л., Гласс М. (2016). «Сульфатирование эпитопа FLAG зависит от совместной экспрессии рецепторов, связанных с G-белком, в модели клеток млекопитающих» . Научные отчеты . 6 : 27316. Бибкод : 2016NatSR...627316H . дои : 10.1038/srep27316 . ПМЦ 4895180 . ПМИД 27273047 .
- ^ Манро С., Пелхэм HR (1984). «Использование пептидной метки для обнаружения белков, экспрессируемых из клонированных генов: картирование делеций функциональных доменов hsp 70 дрозофилы» . Журнал ЭМБО . 3 (13): 3087–93. дои : 10.1002/j.1460-2075.1984.tb02263.x . ПМК 557822 . ПМИД 6526011 .
- ^ Эйнхауэр А, Юнгбауэр А (2001). «Пептид FLAG, универсальная слитая метка для очистки рекомбинантных белков». Журнал биохимических и биофизических методов . 49 (1–3): 455–65. дои : 10.1016/S0165-022X(01)00213-5 . ПМИД 11694294 .
- ^ «Добавление эпитопа к кодирующей последовательности белка: FLAG-тег» . Логика молекулярных подходов к биологическим проблемам . Корнелльский университет.
- ^ FLAG — зарегистрированная торговая марка Sigma-Aldrich Co. LLC.
- ^ патент США 4703004 , Хопп, Томас П.; Бектеш, Сьюзен и Конлон, третий, Пол Дж. и др., «Синтез белка с идентификационным пептидом», опубликовано 27 октября 1987 г., передано Immunex Corp.
- ^ Филд Дж., Никава Дж., Брук Д., Макдональд Б., Роджерс Л., Уилсон И.А., Лернер Р.А., Виглер М. (1988). «Очистка RAS-чувствительного комплекса аденилатциклазы из Saccharomyces cerevisiae с использованием метода добавления эпитопа» . Молекулярная и клеточная биология . 8 (5): 2159–65. дои : 10.1128/mcb.8.5.2159 . ПМЦ 363397 . ПМИД 2455217 .