ФЛЕШ-ЭДТ 2
| |
| Имена | |
|---|---|
| Другие имена
флюоресцеиновое связующее для шпилек с мышьяком; Люмио зеленый
| |
| Идентификаторы | |
3D model ( JSmol )
|
|
| КЭБ | |
| ХЭМБЛ | |
| ХимическийПаук | |
ПабХим CID
|
|
| НЕКОТОРЫЙ | |
Панель управления CompTox ( EPA )
|
|
| Характеристики | |
| С 24 Н 18 Ас 2 О 5 С 4 | |
| Молярная масса | 664.49 g·mol −1 |
| Появление | Твердый |
| Температура плавления | От 169 до 172 ° C (от 336 до 342 ° F; от 442 до 445 К) |
Если не указано иное, данные приведены для материалов в стандартном состоянии (при 25 °C [77 °F], 100 кПа).
| |
FlAsH-EDT 2 представляет собой мышьякорганическое соединение с молекулярной формулой C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Его структура основана на флуоресцеиновом ядре с двумя 1,3,2-дитиарсолановыми заместителями. Он используется в биоаналитических исследованиях в качестве флуоресцентной метки для визуализации белков в живых клетках. [ 1 ] EDT 2 – этандитиола представляет собой аббревиатуру флуоресцинарсенического и собой представляет розоватое - связующего для шпилек бледно - флуорогенное Flash . вещество твердое желтое или Он имеет полуструктурную формулу (C 2 H 4 AsS 2 ) 2 -(C 13 H 5 O 3 )-C 6 H 4 COOH, представляющую собой дитиарсолановые заместители, связанные с гидроксиксантоновым ядром , присоединенным к о -замещенной молекуле. бензойной кислоты .
FlAsH-EDT 2 используется для сайт-специфического мечения, избирательно связываясь с белками, содержащими мотив тетрацистеина ( TC) Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys, и становясь флуоресцентным при связывании. Он демонстрирует неспецифическое связывание с эндогенными белками, богатыми цистеином, то есть он связывается с сайтами, отличными от представляющего интерес (CCXXCC). Дальнейшая оптимизация мотива TC выявила улучшенное сродство связывания FlAsH с мотивом CCPGCC. [ 2 ] и более высокий квантовый выход , когда тетрацистеиновый мотив фланкирован специфическими остатками (HRWCCPGCCKTF или FLNCCPGCCMEP). [ 3 ]
Подготовка
[ редактировать ]
Flash-EDT 2 можно получить в три этапа из флуоресцеина (см. рисунок). [ 1 ]
Образование аддукта Flash-TC
[ редактировать ]
Многие исследования показывают, что трехвалентные соединения мышьяка связываются с парами остатков цистеина. Это связывание ответственно за токсичность многих соединений мышьяка. [ 4 ] Связывание меняется на противоположное с помощью 1,2-этандитиола, который прочно связывается с соединениями мышьяка, о чем свидетельствует стабильность FlAsH-EDT 2 . [ 5 ] Такую прочную связь сера-мышьяк можно снова регулировать путем создания пептидного домена, который проявляет более высокое сродство к мышьяку, например, тетрацистеиновый мотив. Модулируя расстояние между двумя парами остатков цистеина и пространством между мышьяковистыми центрами FlAsH-EDT 2 , можно достичь кооперативной и энтропийно предпочтительной дитиольной мышьяковистой связи. [ 6 ]
Таким образом, связывание FlAsH-EDT 2 подлежит уравновешиванию. Формированию аддукта FlAsH-пептид может способствовать низкая концентрация EDT (ниже 10 мкМ ) и обратить вспять высокую концентрацию EDT (выше 1 мМ). [ 6 ]
Характеристики
[ редактировать ]FlAsH становится флуоресцентным при связывании тетрацистеинового мотива. Он возбуждается при длине волны 508 нм и излучает зелено-желтый цвет свободного флуоресцеина с длиной волны 528 нм. Квантовый выход составляет 0,49 для 250 нМ FlAsH, связанного с модельным тетрацистеинсодержащим пептидом в фосфатно-солевом буфере при pH 7,4. [ 6 ]
Как правило, FlAsH-EDT 2 имеет квантовую эффективность флуоресценции 0,1–0,6 с пределами обнаружения в несколько микромоль для диффузной цитозольной метки и коэффициентами экстинкции 30–80 л ммоль. −1 см −1 . Комплекс FlAsH-пептид также продемонстрировал резонансный перенос энергии флуоресценции (FRET) от флуоресцентных белков, таких как усиленный голубой флуоресцентный белок (ECFP) зеленого флуоресцентного белка (GFP). [ 7 ]
Приложение
[ редактировать ]Flash-EDT 2 обеспечивает менее токсичное и более специфичное флуоресцентное мечение, проницаемое для мембран. [ 8 ] Модификация фрагмента флуоресцеина также позволяет проводить многоцветный анализ. [ 9 ] Было доказано, что он является хорошей альтернативой зеленым флуоресцентным белкам (GFP) с тем преимуществом, что FlAsH-EDT 2 намного меньше ( молярная масса <1 кДа ) по сравнению с GFP (~ 30 кДа), что сводит к минимуму нарушение активности. исследуемого белка. [ 1 ] [ 10 ]
Использовать
[ редактировать ]В прошлом FlAsH-EDT 2 широко использовался для изучения ряда клеточных событий in vivo и субклеточных структур в клетках животных, матричного белка вируса Эбола и неправильного сворачивания белков. С помощью электронной микроскопии FlAsH-EDT 2 также используется для изучения процессов транспортировки белков in situ . [ 11 ] Совсем недавно его использовали в расширенном исследовании растительных клеток, таких как арабидопсис и табак. [ 12 ]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Адамс, Стивен Р.; Цянь, Роджер Ю. (2008). «Приготовление проникающих через мембрану бимышьяков FlAsH-EDT 2 и ReAsH-EDT 2 для флуоресцентного мечения белков, меченных тетрацистеином» . Нат. Протокол. 3 (9): 1527–1534. дои : 10.1038/nprot.2008.144 . ПМЦ 2843588 . ПМИД 18772880 .
- ^ Адамс, Стивен Р.; Кэмпбелл, Роберт Э.; Гросс, Ларри А.; Мартин, Брент Р.; Уолкап, Грант К.; Яо, Юн; Ллопис, Хуан; Цянь, Роджер Ю. (2002). «Новые бимышьяковые лиганды и тетрацистеиновые мотивы для маркировки белков in vitro и in vivo: синтез и биологическое применение». Журнал Американского химического общества . 124 (21): 6063–6076. дои : 10.1021/ja017687n . ПМИД 12022841 .
- ^ Мартин, Брент Р.; Гипманс, Бен Н.Г.; Адамс, Стивен Р.; Цянь, Роджер Ю. (2005). «Оптимизация на основе клеток млекопитающих мотива тетрацистеина, связывающего бимышьяк, для улучшения флуоресценции и сродства». Природная биотехнология . 23 (10): 1308–1314. дои : 10.1038/nbt1136 . ПМИД 16155565 . S2CID 16456334 .
- ^ Калеф, Эдна; Гитлер, Карлос (1994). «Очистка вицинальных дитиолсодержащих белков методом аффинной хроматографии на основе мышьяка». В Сиесе, Хельмут (ред.). Кислородные радикалы в биологических системах, Часть C. Методы энзимологии . Том. 233. Академик Пресс . стр. 395–403. дои : 10.1016/S0076-6879(94)33046-8 . ISBN 9780080883465 . ПМИД 8015475 .
- ^ Уиттакер, Виктор П. (1947). «Экспериментальное исследование «кольцевой гипотезы» токсичности мышьяка» . Биохим. Дж. 41 (1): 56–62. дои : 10.1042/bj0410056 . ПМЦ 1258423 . ПМИД 16748119 .
- ^ Jump up to: а б с Гриффин, Б. Альберт; Адамс, Стивен Р.; Цзянь, Роджер Ю. (1998). «Специфическая ковалентная маркировка рекомбинантных белковых молекул внутри живых клеток». Наука . 281 (5374): 269–272. Бибкод : 1998Sci...281..269G . дои : 10.1126/science.281.5374.269 . ПМИД 9657724 .
- ^ Адамс, Стивен Р.; Кэмпбелл, Роберт Э.; Гросс, Ларри А.; Мартин, Брент Р.; Уолкап, Грант К.; Яо, Юн; Ллопис, Хуан; Цянь, Роджер Ю. (2002). «Новые биарсенические лиганды и тетрацистеиновые мотивы для маркировки белков in vitro и in vivo: синтез и биологические применения». Дж. Ам. хим. Соц. 124 (21): 6063–6076. дои : 10.1021/ja017687n . ПМИД 12022841 .
- ^ Хоффманн, Карстен; Гайетта, Гвидо; Цюрн, Александр; Адамс, Стивен Р.; Террильон, Соня; Эллисман, Марк Х.; Цянь, Роджер Ю.; Лозе, Мартин Дж. (2010). «Флуоресцентное мечение белков, меченных тетрацистеином, в интактных клетках» . Протоколы природы . 5 (10): 1666–1677. дои : 10.1038/nprot.2010.129 . ПМК 3086663 . ПМИД 20885379 .
- ^ TC-FlASH™ II Набор для обнаружения внутриклеточных меток тетрацистеина (зеленая флуоресценция), для визуализации живых клеток.
- ^ Гриффин, Б. Альберт; Адамс, Стивен Р.; Джонс, Джей; Цянь, Роджер Ю. (2000). «Флуоресцентное мечение рекомбинантных белков в живых клетках с помощью FlAsH». В Торнере, Джереми; Эмр, Скотт Д .; Абельсон, Джон Н. (ред.). Применение химерных генов и гибридных белков, Часть B: Клеточная биология и физиология . Методы энзимологии . Том. 327. Академик Пресс . стр. 565–578. дои : 10.1016/S0076-6879(00)27302-3 . ISBN 9780080496825 . ПМИД 11045009 .
- ^ Гайетта, Гвидо; Диринк, Томас Дж.; Адамс, Стивен Р.; Бауэр, Джеймс; Тур, Одед; Лэрд, Дейл В.; Сосинский, Джина Э.; Цянь, Роджер Ю .; Эллисман, Марк Х. (2002). «Многоцветная и электронно-микроскопическая визуализация незаконного оборота коннексина». Наука . 296 (5567): 503–507. Бибкод : 2002Sci...296..503G . дои : 10.1126/science.1068793 . ПМИД 11964472 . S2CID 16397816 .
- ^ Эстевес, Хосе М.; Сомервилл, Крис (2006). «Флуоресцентная визуализация живых клеток синтетических пептидов, экспрессируемых в Arabidopsis и табаке, на основе Flash» . БиоТехники . 41 (5): 569–574. дои : 10.2144/000112264 . ПМИД 17140113 .