Дот-блот
Дот -блот (или слот-блот ) — это метод молекулярной биологии, используемый для обнаружения белков. Он представляет собой упрощение метода вестерн-блоттинга , за исключением того, что обнаруживаемые белки сначала не разделяются электрофорезом . Вместо этого образец наносится непосредственно на мембрану в одном месте и выполняется процедура блоттинга.
Этот метод обеспечивает значительную экономию времени, поскольку не требуются хроматография или гель-электрофорез , а также сложные процедуры блоттинга геля. Однако он не дает никакой информации о размере целевого белка. [1]
Использование
[ редактировать ]Выполнение дот-блоттинга по своей сути аналогично проведению вестерн-блоттинга, но имеет преимущество более высокой скорости и меньших затрат. [2] Дот-блоттинг также проводят для проверки связывающей способности антитела. [3]
Методология
[ редактировать ]Общий протокол дот-блоттинга включает в себя нанесение 1–2 микролитров образцов на мембрану из нитроцеллюлозы или ПВДФ и высыхание на воздухе. Образцы могут быть в форме супернатантов тканевых культур, сыворотки крови, клеточных экстрактов или других препаратов. [4] После нанесения образцов белка на мембрану мембрану помещают в пластиковый контейнер и последовательно инкубируют в блокирующем буфере, растворах антител или промывном буфере на шейкере. После связывания антител мембрану инкубируют с хемилюминесцентным субстратом и визуализируют.
Вакуумный дот-блот-аппарат использовался для облегчения процесса промывки и инкубации за счет использования вакуума для извлечения раствора из-под мембраны, которая собрана между несколькими слоями планшетов, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между лунками для образцов, удерживать отработанный раствор и обеспечить силу всасывания. Для регистрации сигнала хемилюминесценции аппарат необходимо разобрать, вынуть мембрану и обернуть прозрачной пластиковой пленкой.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ «Вестерн-блоттинг: тест-блоты, слот-блоттинг и дот-блоттинг» . Био-Рад . Проверено 8 августа 2024 г.
- ^ Ченг, Ли-Тин; Цзэн, Юй-Цзин; Чу, Чун-Йен; Ван, Сянь-Ю (декабрь 2019 г.). «Разработка быстрого дот-блоттинга для титрования вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота» . Ветеринарное исследование BMC . 15 (1). дои : 10.1186/s12917-019-2059-6 . ПМИД 31477093 .
- ^ Рупрехт, Кевин Р.; Наир, Рад К.; Харвик, Ларисса К.; Гроте, Джонатан; Белижер, Гангамани С.; Реге, Сушил Д.; Чен, Ён-Йи; Линь, Чжэнь; Фишпо, Джеффри Р. (15 декабря 2010 г.). «Разработка дот-блот-анализа для скрининга моноклональных антител к низкомолекулярным лекарственным средствам». Аналитическая биохимия . 407 (2): 160–164. дои : 10.1016/j.ab.2010.08.003 . ПМИД 20696124 .
- ^ «Протокол дот-блоттинга» . абкам . 21 мая 2023 г. Проверено 8 августа 2024 г.