Микромасштабный термофорез
Микромасштабный термофорез ( МСТ ) — технология биофизического анализа взаимодействий между биомолекулами . Микромасштабный термофорез основан на обнаружении температурно-индуцированного изменения флуоресценции мишени в зависимости от концентрации нефлуоресцентного лиганда. Наблюдаемое изменение флуоресценции основано на двух различных эффектах. С одной стороны, он основан на изменении интенсивности флуоресцентного зонда, связанном с температурой (TRIC), на которое могут влиять события связывания. С другой стороны, он основан на термофорезе — направленном движении частиц в микроскопическом градиенте температуры . Любое изменение химического микроокружения флуоресцентного зонда, а также изменения гидратной оболочки биомолекул приводят к относительному изменению флуоресценции, регистрируемой при приложении температурного градиента, и могут быть использованы для определения сродства связывания . МСТ позволяет измерять взаимодействия непосредственно в растворе без необходимости иммобилизации на поверхность (безиммобилизационная технология).
Приложения
[ редактировать ]Близость
[ редактировать ]- между любыми биомолекулами [1] включая белки , ДНК , [2] РНК , [3] пептиды, [4] маленькие молекулы , [5] фрагменты [6] и ионы
- для взаимодействия с высокомолекулярными комплексами, сборками больших молекул, даже с липосомами , [7] везикулы , нанодиски , [8] наночастицы [9] и вирусы
- в любом буфере, включая сыворотку и клеточный лизат [4]
- в конкурентных экспериментах (например, с субстратом и ингибиторами)
Термодинамические параметры
[ редактировать ]MST использовался для оценки энтальпийного и энтропийного вклада в биомолекулярные взаимодействия. [10]
Дополнительная информация
[ редактировать ]- Свойства образца (однородность, агрегированность, стабильность)
- Множественные сайты связывания, кооперативность
Технология
[ редактировать ]MST основан на количественном обнаружении изменения флуоресценции образца при изменении температуры. Флуоресценция целевой молекулы может быть внешней или внутренней (ароматические аминокислоты ) и изменяется при температурных градиентах из-за двух различных эффектов. С одной стороны, изменение интенсивности, связанное с температурой (TRIC), которое описывает внутреннее свойство флуорофоров изменять интенсивность флуоресценции в зависимости от температуры. На степень изменения интенсивности флуоресценции влияет химическое окружение флуоресцентного зонда, которое может быть изменено в событиях связывания из-за конформационных изменений или близости лигандов . [11] [12] С другой стороны, МСТ также основан на направленном движении молекул по градиентам температуры — эффект, получивший название термофореза. Пространственная разница температур ΔT приводит к изменению концентрации молекул в области повышенной температуры, количественно определяемой коэффициентом Соре S T :c hot /c cold = exp(-S T ΔT). [13] [14] И TRIC, и термофорез вносят вклад в регистрируемый сигнал при измерениях MST следующим образом: ∂/∂T(cF)=c∂F/∂T+F∂c/∂T. Первый член в этом уравнении c∂F/∂T описывает TRIC как изменение интенсивности флуоресценции (F) в зависимости от температуры (T), тогда как второй член F∂c/∂T описывает термофорез как изменение концентрации частиц. в) в зависимости от температуры. Термофорез зависит от интерфейса между молекулой и растворителем. В условиях постоянного буфера термофорез исследует размер, заряд и энтропию сольватации молекул. Термофорез флуоресцентно меченной молекулы А обычно значительно отличается от термофореза комплекса молекула-мишень AT из-за различий в размере, заряде и энтропии сольватации. Эта разница в термофорезе молекулы используется для количественной оценки связывания в экспериментах по титрованию в условиях постоянного буфера.
Термофоретическое движение флуоресцентно-меченной молекулы измеряется путем мониторинга распределения флуоресценции F внутри капилляра. Микроскопический градиент температуры создается ИК-лазером, который фокусируется в капилляре и сильно поглощается водой. Температура водного раствора в лазерном пятне повышается на ΔT=1-10 К. Перед включением ИК-лазера однородное распределение флуоресценции F cold внутри капилляра наблюдается . Когда ИК-лазер включен, два эффекта происходят в одном и том же временном масштабе, внося вклад в новое распределение флуоресценции F hot . Термическая релаксация вызывает зависимое от связывания падение флуоресценции красителя из-за его локальной реакции на скачок температуры, зависящей от окружающей среды (TRIC). В то же время молекулы обычно перемещаются из локально нагретой области во внешние холодные области. Локальная концентрация молекул уменьшается в нагретой области до тех пор, пока не достигнет стационарного распределения.
В то время как массовая диффузия D определяет кинетику истощения, S T определяет установившееся соотношение концентраций c hot /c cold =exp(-S T ΔT) ≈ 1-S T ΔT при повышении температуры ΔT. Нормализованная флуоресценция F норма =F горячая /F холодная измеряет в основном это соотношение концентраций, в дополнение к TRIC ∂F/∂T. В линейном приближении находим: F норма =1+(∂F/∂TS T )ΔT. Из-за линейности интенсивности флуоресценции и термофоретического истощения нормализованная флуоресценция несвязанной молекулы F- нормы (А) и связанной комплексной F- нормы (АТ) накладываются линейно. Обозначая x долю молекул, связанных с мишенями, изменяющийся сигнал флуоресценции во время титрования мишени T определяется следующим образом: F норма = (1-x) F норма (A) + x F норма (AT). [11]
Количественные параметры связывания получают с помощью серийного разведения связывающего субстрата. Откладывая норму F от логарифма различных концентраций серии разбавлений, получают сигмоидальную кривую связывания. Эту кривую связывания можно напрямую согласовать с нелинейным решением закона действия масс константу диссоциации K D. , в результате чего получить [15] [16] [17]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Асмари М., Ратих Р., Альхазми Х.А., Эль Диб С. (февраль 2018 г.). «Термофорез для характеристики биомолекулярного взаимодействия» (PDF) . Методы . 146 : 107–119. дои : 10.1016/j.ymeth.2018.02.003 . ПМИД 29438829 . S2CID 3374888 .
- ^ Мюллер А.М., Брейтспрехер Д., Дур С., Бааске П., Шуберт Т., Ленгст Г. (2017). «Микромасштабный термофорез : быстрый и точный метод количественного определения взаимодействий белка и нуклеиновой кислоты в растворе». Микромасштабный термофорез: быстрый и точный метод количественного определения белок-нуклеиновых кислотных взаимодействий в растворе . Методы молекулярной биологии. Том. 1654. стр. 151–164. дои : 10.1007/978-1-4939-7231-9_10 . ISBN 978-1-4939-7230-2 . ПМИД 28986788 .
- ^ Филарский М., Зиллнер К., Арайя И., Вильяр-Гареа А., Меркл Р., Лэнгст Г., Нимет А. (2015). «Удлиненный АТ-крючок представляет собой новый мотив связывания РНК» . Биология РНК . 12 (8): 864–76. дои : 10.1080/15476286.2015.1060394 . ПМЦ 4615771 . ПМИД 26156556 .
- ^ Jump up to: а б Зайдель С.А., Дейкман П.М., Леа В.А., ван ден Богаарт Г., Джерабек-Виллемсен М., Лазич А. и др. (2013). «Микромасштабный термофорез позволяет количественно оценить биомолекулярные взаимодействия в ранее сложных условиях» . Методы . 59 (3): 301–15. дои : 10.1016/j.ymeth.2012.12.005 . ПМЦ 3644557 . ПМИД 23270813 .
- ^ Зайдель С.А., Винкен К.Дж., Гейсслер С., Джерабек-Виллемсен М., Дур С., Райтер А., Траунер Д., Браун Д., Бааске П. (2012). «Микромасштабный термофорез без меток различает сайты и аффинность связывания белок-лиганд» . Энджью. хим. Межд. Эд. англ . 51 (42): 10656–9. дои : 10.1002/anie.201204268 . ПМЦ 3588113 . ПМИД 23001866 .
- ^ Линке П., Аманинг К., Машбергер М., Валле Ф., Штайер В., Бааске П., Дур С., Брайтспрехер Д., Рак А. (апрель 2016 г.). «Автоматизированный метод микромасштабного термофореза для обнаружения свинцов на основе фрагментов» . Журнал биомолекулярного скрининга . 21 (4): 414–21. дои : 10.1177/1087057115618347 . ПМК 4800460 . ПМИД 26637553 .
- ^ Джерабек-Виллемсен М., Винкен С.Дж., Браун Д., Бааске П., Дур С. (август 2011 г.). «Исследование молекулярного взаимодействия с использованием микромасштабного термофореза» . Технологии анализа и разработки лекарств . 9 (4): 342–53. дои : 10.1089/adt.2011.0380 . ПМК 3148787 . ПМИД 21812660 .
- ^ Дейкман П.М., Уоттс А. (ноябрь 2015 г.). «Липидная модуляция ранних сигнальных событий рецептора, связанного с G-белком» . Biochimica et Biophysical Acta (BBA) – Биомембраны . 1848 (11 часть А): 2889–97. дои : 10.1016/j.bbamem.2015.08.004 . ПМИД 26275588 .
- ^ Виланова О, Миттаг Дж. Дж., Келли П. М., Милани С., Доусон К. А., Рэдлер Дж. О., Францезе Дж. (декабрь 2016 г.). «Понимание кинетики формирования короны белков-наночастиц» . АСУ Нано . 10 (12): 10842–10850. дои : 10.1021/acsnano.6b04858 . ПМК 5391497 . ПМИД 28024351 .
- ^ Джерабек-Виллемсен М., Андре Т., Ваннер А., Рот Х.М., Дур С., Бааске П., Брейтспрехер Д. (2014). «Микромасштабный термофорез: анализ взаимодействия и не только» . Журнал молекулярной структуры . 1077 : 101–113. Бибкод : 2014JMoSt1077..101J . doi : 10.1016/j.molstruc.2014.03.009 .
- ^ Jump up to: а б Бааске П., Винкен С.Дж., Райнек П., Дур С., Браун Д. (2010). «Оптический термофорез для количественной оценки буферной зависимости связывания аптамеров». Энджью. хим. Межд. Эд. англ . 49 (12): 1–5. дои : 10.1002/anie.200903998 . ПМИД 20186894 .
- «Горячий путь к новым лекарствам» . Физика.орг . 24 февраля 2010 г.
- ^ Гупта А.Дж., Дур С., Баске П. (2018). «Микромасштабный термофорез (МСТ)». Энциклопедия биофизики стр. 100-1 1–5 дои : 10.1007/978-3-642-35943-9_10063-1 . ISBN 9783642359439 .
- ^ Дур С., Браун Д. (2006). «Почему молекулы движутся по градиенту температуры» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 103 (52): 19678–82. Бибкод : 2006PNAS..10319678D . дои : 10.1073/pnas.0603873103 . ПМК 1750914 . ПМИД 17164337 .
- ^ Райнек П., Винкен С.Дж., Браун Д. (2010). «Термофорез одноцепочечной ДНК». Электрофорез . 31 (2): 279–86. дои : 10.1002/elps.200900505 . ПМИД 20084627 . S2CID 36614196 .
- ^ Винкен С.Дж., Бааске П., Ротбауэр У., Браун Д., Дур С. (2010). «Анализ связывания белков в биологических жидкостях с использованием микромасштабного термофореза» . Нат Коммун . 1 (7): 100. Бибкод : 2010NatCo...1..100W . дои : 10.1038/ncomms1093 . ПМИД 20981028 .
- ^ Бааске П., Винкен С., Дур С. (2009). «Оптически генерируемый термофорез для биоанализа» ( PDF) . Биофотоника (на немецком языке): 22–24. [ мертвая ссылка ]
- ^ Винкен С.Дж., Бааске П., Дур С., Браун Д. (2011). «Кривые термофореза плавления количественно определяют конформацию и стабильность РНК и ДНК» . Нуклеиновые кислоты Рез . 39 (8): е52. дои : 10.1093/nar/gkr035 . ПМК 3082908 . ПМИД 21297115 .