✖


Jump to content

Брэдфордский белковый анализ

Эта статья о научной процедуре. Чтобы узнать о других значениях, см. Брэдфорд (значения) .

Анализ белка Брэдфорда (также известный как анализ белка Кумасси) был разработан Мэрион М. Брэдфорд в 1976 году. [1] Это быстрый и точный [2] спектроскопический аналитический метод, используемый для измерения концентрации белка в растворе. Реакция зависит от аминокислотного состава измеряемых белков.

Принцип

[ редактировать ]
Рисунок 1. Кумасси бриллиантовый синий G-250, связующий краситель для метода Брэдфорда.
Цветная реакция белка и реактива Брэдфорда

Анализ Брэдфорда, колориметрический белка анализ , основан на сдвиге поглощения красителя Кумасси бриллиантового синего G-250 . Краситель Кумасси бриллиантовый синий G-250 существует в трех формах: анионная (синяя), нейтральная (зеленая) и катионная (красная). [3] В кислых условиях красная форма красителя превращается в синюю форму, связываясь с анализируемым белком. Если нет связывающегося белка, раствор останется коричневым. Краситель образует прочный нековалентный комплекс с карбоксильной группой белка за счет силы Ван-дер-Ваальса и аминогруппой за счет электростатических взаимодействий. [1] Во время образования этого комплекса красная форма красителя Кумасси сначала отдает свой свободный электрон ионизируемым группам белка, что вызывает нарушение нативного состояния белка и, как следствие, обнажает его гидрофобные карманы. белка Эти карманы в третичной структуре нековалентно связываются с неполярной областью красителя посредством первого взаимодействия связей ( силы Ван-дер-Ваальса ), которые располагают положительные аминогруппы вблизи отрицательного заряда красителя. Связь еще больше усиливается за счет второго взаимодействия между ними, ионного взаимодействия. Когда краситель связывается с белком, он вызывает сдвиг от 465 нм до 595 нм, поэтому показания оптической плотности снимаются при 595 нм. [4]

Катионная ( несвязанная ) форма имеет зеленый/красный цвет и имеет спектра поглощения исторически сложившийся максимум при 465 нм . Анионно - связанная форма красителя, которая удерживается вместе гидрофобными и ионными взаимодействиями, имеет исторически сложившийся максимум спектра поглощения при 595 нм . [5] Увеличение поглощения при 595 нм пропорционально количеству связанного красителя и, следовательно, количеству (концентрации) белка, присутствующего в образце. [6]

В отличие от других анализов белков, анализ белков по Брэдфорду менее подвержен влиянию различных химических соединений, таких как натрий, калий или даже углеводов, таких как сахароза, которые могут присутствовать в образцах белков. [2] Исключением являются повышенные концентрации моющего средства . Додецилсульфат натрия (ДСН), распространенный детергент, можно найти в белковых экстрактах, поскольку он используется для лиза клеток путем разрушения липидного бислоя мембраны и для денатурации белков для SDS-PAGE . В то время как другие детергенты мешают анализу при высоких концентрациях, помехи, вызванные SDS, имеют два разных типа, и каждый из них возникает при разных концентрациях. Когда концентрации ДСН ниже критической концентрации мицелл (известной как КМЦ, от 0,00333% масс./об. до 0,0667%) в растворе красителя Кумасси, детергент имеет тенденцию прочно связываться с белком, ингибируя сайты связывания белка для красящего реагента. Это может привести к занижению концентрации белка в растворе. Когда концентрации SDS превышают CMC, моющее средство прочно связывается с зеленой формой красителя Кумасси, вызывая сдвиг равновесия, тем самым образуя больше синей формы. Это вызывает увеличение поглощения при 595 нм независимо от присутствия белка. [6]

Другие помехи могут исходить от буфера, используемого при приготовлении образца белка. Высокая концентрация буфера приведет к завышенной концентрации белка из-за истощения свободных протонов из раствора конъюгатным основанием из буфера. Это не будет проблемой, если использовать низкую концентрацию белка (впоследствии буфера). [6]

Для измерения оптической плотности бесцветного соединения необходимо провести анализ Брэдфорда. Некоторые бесцветные соединения, такие как белки, можно определить количественно при оптической плотности 280 нм из-за присутствия ароматических колец, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин, но если ни одна из этих аминокислот не присутствует, поглощение невозможно измерить при 280 нм. [7]

Преимущества

[ редактировать ]

Многие белковосодержащие растворы имеют наибольшее поглощение при 280 нм в спектрофотометрическом диапазоне УФ. Для этого требуются спектрофотометры, способные проводить измерения в УФ-диапазоне, чего многие не могут. Кроме того, максимумы поглощения при 280 нм требуют, чтобы белки содержали ароматические аминокислоты, такие как тирозин (Y), фенилаланин (F) и/или триптофан (W). Не все белки содержат эти аминокислоты, и этот факт искажает измерения концентрации. Если в образце присутствуют нуклеиновые кислоты, они также будут поглощать свет с длиной волны 280 нм, что еще больше искажает результаты. Используя анализ белка по Брэдфорду, можно избежать всех этих осложнений, просто смешивая образцы белков с красителем Кумасси бриллиантовый синий G-250 (реагент Брэдфорда) и измеряя их поглощение при 595 нм, что находится в видимом диапазоне. [8] и может быть точно измерен с помощью камеры мобильного смартфона. [9]

Процедура анализа белка по Брэдфорду очень проста и понятна. Это делается за один этап: реагент Брэдфорда добавляется в пробирку вместе с образцом. После хорошего перемешивания смесь почти сразу же приобретает синий цвет. Когда краситель связывается с белками в ходе процесса, занимающего около 2 минут, происходит изменение максимума поглощения красителя с 465 нм до 595 нм в кислых растворах. [2] Кроме того, связывание белка запускает метахроматическую реакцию, о чем свидетельствует появление видов, поглощающих свет с длиной волны около 595 нм, что указывает на непротонированную форму. [10] Этот краситель создает прочные нековалентные связи с белками посредством электростатических взаимодействий с амино- и карбоксильными группами, а также взаимодействий Ван-дер-Ваальса. Только молекулы, которые связываются с белками в растворе, демонстрируют такое изменение поглощения, что устраняет опасения, что несвязанные молекулы красителя могут внести вклад в экспериментально полученные показания поглощения. Этот процесс более выгоден, поскольку он дешевле других методов, прост в использовании и обладает высокой чувствительностью красителя к белку. [11]

После 5 минут инкубации поглощение можно измерить при длине волны 595 нм с помощью спектрофотометра или камеры мобильного смартфона ( метод RGBradford ). [9]

Этот анализ является одним из самых быстрых анализов белков. [12] Общее время, необходимое для настройки и завершения анализа, составляет менее 30 минут. [13] Весь эксперимент проводится при комнатной температуре.

Анализ белка в Брэдфорде позволяет измерить количество белка от 1 до 20 мкг. [14] Это чрезвычайно чувствительная техника.

Красящий реагент представляет собой стабильный готовый к использованию продукт, приготовленный в фосфорной кислоте . Он может оставаться при комнатной температуре до 2 недель, прежде чем начнет разлагаться.

Образцы белков обычно содержат соли, растворители, буферы, консерванты, восстановители и хелатирующие агенты металлов. Эти молекулы часто используются для солюбилизации и стабилизации белков. Другие анализы белков, такие как BCA и Лоури, неэффективны, поскольку молекулы, такие как восстановители, мешают анализу. [15] Использование Брэдфорда может быть выгодным по сравнению с этими молекулами, поскольку они совместимы друг с другом и не будут мешать. [16]

Линейный график, полученный в результате анализа (поглощение в зависимости от концентрации белка в мкг/мл), можно легко экстраполировать для определения концентрации белков, используя наклон линии.

Это чувствительная техника. Это также очень просто: измерение ОП при 595 нм после 5 минут инкубации. В этом методе также можно использовать спектрофотометр Vis. [17] или камеру мобильного смартфона ( метод RGBradford ). [9]

Недостатки

[ редактировать ]

Анализ Брэдфорда является линейным в коротком диапазоне, обычно от 0 мкг/мл до 2000 мкг/мл, что часто приводит к необходимости разведения образца перед анализом. При выполнении этих разведений ошибка в одном разведении усугубляется при последующих разведениях, что приводит к линейной зависимости, которая не всегда может быть точной.

Основные условия и моющие средства, такие как SDS, могут повлиять на способность красителя связываться с белком через его боковые цепи. [12]

Реагенты в этом методе имеют тенденцию окрашивать пробирки. Нельзя использовать одни и те же пробирки, поскольку пятно может повлиять на показания поглощения. Этот метод также чувствителен ко времени. Если тестируется более одного раствора, важно убедиться, что каждый образец инкубируется в течение одинакового времени для точного сравнения. [18]

Ограничивающим фактором в использовании красителей для определения белка на основе кумасси является значительная разница в цвете, наблюдаемая для разных белков. [19] Этот ограничивающий фактор особенно очевиден в образцах белков, богатых коллагеном, таких как экстракты поджелудочной железы, где методы Лоури и Брэдфорда имеют тенденцию недооценивать содержание белка.

Его также ингибирует присутствие детергентов, хотя эту проблему можно облегчить добавлением циклодекстринов в аналитическую смесь. [20]

Большая часть нелинейности возникает из-за равновесия между двумя различными формами красителя, которое нарушается добавлением белка. Анализ Брэдфорда линеаризуется путем измерения соотношения поглощений 595 на 450 нм. Этот модифицированный метод Брэдфорда примерно в 10 раз более чувствителен, чем обычный. [21]

Краситель Coomassie Blue G250, используемый для связывания белков в оригинальном методе Брэдфорда, легко связывается с группами белков аргинина и лизина. Это недостаток, поскольку предпочтение красителя связываться с этими аминокислотами может привести к различному ответу анализа между разными белками. Чтобы исправить это изменение, в исходный метод были внесены изменения, такие как повышение pH за счет добавления NaOH или добавления красителя. Хотя эти модификации приводят к снижению чувствительности анализа, модифицированный метод становится чувствительным к детергентам, которые могут влиять на качество пробы. [22]

Будущее Брэдфордского анализа белка

[ редактировать ]

В настоящее время разрабатываются новые модификации улучшенного анализа белка в Брэдфорде, которые специально направлены на повышение точности обнаружения белков коллагена. Одна заметная модификация включает в себя добавление небольших количеств, примерно 0,0035%, додецилсульфата натрия (ДСН). Было показано, что включение SDS приводит к четырехкратному увеличению цветовой реакции для трех ключевых белков коллагена — коллагена типов I, III и IV — при одновременном снижении поглощения неколлагеновых белков. [19]

Эта простая модификация в приготовлении реагента привела к тому, что анализы Брэдфорда дали аналогичные кривые отклика как для коллагеновых, так и для неколлагеновых белков, что расширило использование анализов Брэдфорда в образцах, содержащих белки с высоким содержанием коллагена.

Пример процедуры Брэдфорда

[ редактировать ]

Материалы

[ редактировать ]
  • Лиофилизированный гамма-глобулин бычьей плазмы
  • Кумасси бриллиантовый синий 1
  • 0,15 М NaCl
  • Спектрофотометр и кюветы или камера мобильного смартфона ( метод RGBradford ). [9]
  • Микропипетки

Процедура (стандартный анализ, 20–150 мкг белка; 200–1500 мкг/мл)

[ редактировать ]
  1. Подготовьте серию стандартов, разбавленных 0,15 М NaCl до конечной концентрации 0 (холостой уровень = отсутствие белка), 250, 500, 750 и 1500 мкг/мл. Также подготовьте серийные разведения неизвестного образца для измерения.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из вышеперечисленных веществ в отдельную пробирку (или пробирку спектрофотометра, если используете Spectronic 20 ).
  3. Добавьте по 5,0 мл кумасси синего в каждую пробирку и перемешайте на вортексе или переворачивая.
  4. Настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм, используя пробирку, не содержащую белка (пустую).
  5. Подождите 5 минут и прочитайте каждый из стандартов и каждый образец при длине волны 595 нм.
  6. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Рассчитайте коэффициент экстинкции и вычислите концентрации неизвестных образцов.

Процедура (микроанализ, 1–10 мкг белка/мл)

[ редактировать ]
  1. Подготовьте стандартные концентрации белка 1, 5, 7,5 и 10 мкг/мл. Подготовьте заготовку только из NaCl. Подготовьте серию разведений образцов.
  2. Добавьте по 100 мкл каждого из вышеперечисленных веществ в отдельные пробирки (используйте микроцентрифужные пробирки) и добавьте 1,0 мл кумасси синего в каждую пробирку.
  3. Включите и настройте спектрофотометр на длину волны 595 нм и очистите спектрофотометр с помощью кювет объемом 1,5 мл или используйте камеру мобильного смартфона ( метод RGBradford ). [9]
  4. Подождите 2 минуты и определите оптическую плотность каждого стандарта и образца при длине волны 595 нм.
  5. Постройте график зависимости поглощения стандартов от их концентрации. Рассчитайте коэффициент экстинкции и вычислите концентрации неизвестных образцов.

Используя полученные данные, найти концентрацию неизвестных

[ редактировать ]

Таким образом, чтобы найти стандартную кривую, необходимо использовать различные концентрации БСА ( бычьего сывороточного альбумина ). [2] для создания стандартной кривой с концентрацией, отложенной по оси X, и поглощением, отложенной по оси Y. Используется только узкая концентрация БСА (2–10 мкг/мл) для создания точной стандартной кривой. [23] Использование широкого диапазона концентраций белка затруднит определение концентрации неизвестного белка. Эта стандартная кривая затем используется для определения концентрации неизвестного белка. Ниже подробно описывается, как перейти от стандартной кривой к концентрации неизвестного.

Сначала добавьте линию наилучшего соответствия или линейную регрессию и отобразите уравнение на диаграмме. В идеале Р 2 значение будет как можно ближе к 1. R представляет собой сумму квадратов значений подгонки, вычтенных из каждой точки данных. Следовательно, если Р 2 намного меньше единицы, рассмотрите возможность повторения эксперимента, чтобы получить более надежные данные. [24]

График 1. Фактические данные по BSA, полученные с помощью микромасштабного УФ-ВИД спектрофотометра.

Уравнение, отображаемое на диаграмме, дает возможность расчета оптической плотности и, следовательно, концентрации неизвестных образцов. На графике 1 x — это концентрация, а y — оптическая плотность, поэтому необходимо перестроить уравнение, чтобы найти x и ввести оптическую плотность измеряемого неизвестного. [25] Вполне вероятно, что неизвестный материал будет иметь показатели поглощения, выходящие за пределы стандартного диапазона. Их не следует включать в расчет, поскольку данное уравнение не может применяться к числам за пределами его ограничений.В больших масштабах необходимо вычислить коэффициент экстинкции, используя закон Бера-Ламберта A = εLC, в котором A — измеренное поглощение, ε — наклон стандартной кривой, L — длина кюветы, а C — концентрация. определяется. [26] В микромасштабе кювету использовать нельзя, поэтому для нахождения x достаточно ее переставить.

Таблица 1. Фактические данные анализа для определения концентрации неизвестного вещества на основе линии наилучшего соответствия приведенной выше стандартной кривой

Чтобы достичь концентрации, которая имеет смысл с данными, разведения, концентрации и единицы измерения неизвестных должны быть нормализованы (таблица 1). Для этого необходимо разделить концентрацию на объем белка, чтобы нормализовать концентрацию, и умножить на количество разбавленного белка, чтобы скорректировать любое разведение белка, сделанное перед выполнением анализа.

Альтернативные анализы

[ редактировать ]

Альтернативные анализы белка включают:

Ссылки

[ редактировать ]
  1. ^ Jump up to: а б Нинфа, Александр Дж; Баллоу, Дэвид П.; Бенор, Мэрили (2008). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Уайли. п. 113.
  2. ^ Jump up to: а б с д Брэдфорд, Мэрион (1976). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения количества белка в микрограммах с использованием принципа связывания белка с красителем» (PDF) . Аналитическая биохимия . 72 (1–2): 248–254. дои : 10.1006/abio.1976.9999 . PMID   942051 – через Google Scholar.
  3. ^ «Быстрый старт анализа белка TM Bradford» (PDF) . www.bio-rad.com .
  4. ^ Брэдфорд, Мэрион М. (май 1976 г.). «Быстрый и чувствительный метод количественного определения микрограммов белка, использующий принцип связывания белка с красителем». Аналитическая биохимия . 72 (1–2): 248–254. дои : 10.1006/abio.1976.9999 . ПМИД   942051 .
  5. ^ «Определение белка по методу Брэдфорда» .
  6. ^ Jump up to: а б с Крюгер, Николас Дж. (2009), Уокер, Джон М. (редактор), «Брэдфордский метод количественного определения белка» , Справочник по белковым протоколам , Справочники по протоколам Springer, Тотова, Нью-Джерси: Humana Press, стр. 17–24, дои : 10.1007/978-1-59745-198-7_4 , ISBN  978-1-60327-474-6 , получено 27 июня 2022 г.
  7. ^ П., Баллоу, Дэвид; Мэрили., Бенор (2010). Фундаментальные лабораторные подходы в области биохимии и биотехнологии . Джон Уайли. ISBN  9780470087664 . OCLC   420027217 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  8. ^ Нинфа, Баллоу, Бенор, Александр Дж., Дэвид П., Мэрили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Соединенные Штаты Америки: John Wiley & Sons, Inc., стр. 110, 113. ISBN.  978-0-470-08766-4 . {{cite book}}: CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  9. ^ Jump up to: а б с д и Морейра, Дэниел К. (октябрь 2022 г.). «РГБредфорд: точное измерение концентрации белка с помощью камеры смартфона и соотношения интенсивности синего и зеленого» . Аналитическая биохимия . 655 : 114839. doi : 10.1016/j.ab.2022.114839 . ПМИД   35987416 . S2CID   251684735 .
  10. ^ Сапан, Кристина В.; Лундблад, Роджер Л.; Прайс, Николас К. (апрель 1999 г.). «Методы колориметрического анализа белков» . Биотехнология и прикладная биохимия . 29 (2): 99–108. дои : 10.1111/j.1470-8744.1999.tb00538.x . ISSN   0885-4513 . ПМИД   10075906 .
  11. ^ Нинфа, Александр Дж.; Баллоу, Дэвид П.; Бенор, Мэрили (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . John Wiley & Sons Inc. с. 113. ИСБН  978-0470087664 .
  12. ^ Jump up to: а б Окутуджу, Бурку; Динчер, Айшше; Хабиб, Омер; Зихныоглу, Фиген (1 августа 2007 г.). «Сравнение пяти методов определения общей концентрации белка в плазме». Журнал биохимических и биофизических методов . 70 (5): 709–711. дои : 10.1016/j.jbbm.2007.05.009 . ПМИД   17597224 .
  13. ^ «Техническое руководство по анализу белков» (PDF) .
  14. ^ «4.5.Определение концентрации белка» . elte.prompt.hu . Архивировано из оригинала 21 сентября 2016 г. Проверено 19 мая 2016 г.
  15. ^ барбоса, Хелдер; Слейтер К. Х., Найджел (3 августа 2009 г.). «Количественное определение белка в присутствии поли(этиленгликоля) и декстрана с использованием метода Брэдфорда». Аналитическая биохимия . 395 (1): 108–110. дои : 10.1016/j.ab.2009.07.045 . ПМИД   19653991 .
  16. ^ Нинфа, Александр Дж. (2010). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Уайли. стр. 117–118. ISBN  978-0470087664 .
  17. ^ Нинфа, Баллоу (1998). Фундаментальные подходы к биохимии и биотехнологии . Fitzgerald Science Press, Бетесда, Мэриленд. стр. 114–116. ISBN  978-0470087664 .
  18. ^ Нинфа, Александр Дж; Баллоу, Дэвид П.; Бенор, Мэрили (2009). Фундаментальные лабораторные подходы к биохимии и биотехнологии . Уайли. п. 113.
  19. ^ Jump up to: а б Лопес, Хосе Мануэль; Империал, Сантьяго; Вальдеррама, Родриго; Наварро, Сальвадор (29 октября 1993 г.). «Улучшенный анализ белка Брэдфорда на белки коллагена» . Клиника Химика Акта . 220 (1): 91–100. дои : 10.1016/0009-8981(93)90009-S . ISSN   0009-8981 . ПМИД   8287563 .
  20. ^ Рабиллу, Тьерри (2018). «Оптимизация анализа cydex blue: одноэтапный колориметрический анализ белка с использованием циклодекстринов, совместимый с детергентами и восстановителями» . ПЛОС ОДИН . 13 (4): e0195755. Бибкод : 2018PLoSO..1395755R . дои : 10.1371/journal.pone.0195755 . ПМЦ   5895047 . ПМИД   29641569 .
  21. ^ Зор, Цафрир; Селинджер, Цви (1 мая 1996 г.). «Линеаризация Брэдфордского анализа белка повышает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования». Аналитическая биохимия . 236 (2): 302–308. дои : 10.1006/abio.1996.0171 . ПМИД   8660509 .
  22. ^ Крюгер, Николас Дж. (2002). «Метод Брэдфорда для количественного определения белка». Справочник по белковым протоколам, . стр. 15–22. дои : 10.1385/1-59259-169-8:15 . ISBN  1-59259-169-8 .
  23. ^ «Линеаризация Брэдфордского анализа белков повышает его чувствительность: теоретические и экспериментальные исследования» (PDF) . www.tau.ac. ​20 ноября 1995 г.
  24. ^ Олбрайт, Брайан (2009). Математическое моделирование в Excel . Джонс и Бартлетт Обучение. п. 60. ИСБН  978-0763765668 .
  25. ^ Стивенсон, Фрэнк Гарольд (2003). Расчеты для молекулярной биологии и биотехнологии: Руководство по математике в лаборатории . Академическая пресса. стр. 252 . ISBN  978-0126657517 .
  26. ^ Ибаньес, Хорхе Г. (2007). Химия окружающей среды: основы . стр. 60 . ISBN  978-0387260617 .

Дальнейшее чтение

[ редактировать ]
[ редактировать ]
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Bradford_protein_assay&oldid=1230310906"
Arc.Ask3.Ru: конец переведенного документа.
Arc.Ask3.Ru
Номер скриншота №: ba4fbffb45438d286aabbb2a0679c0b2__1719004620
URL1:https://arc.ask3.ru/arc/aa/ba/b2/ba4fbffb45438d286aabbb2a0679c0b2.html
Заголовок, (Title) документа по адресу, URL1:
Bradford protein assay - Wikipedia
Данный printscreen веб страницы (снимок веб страницы, скриншот веб страницы), визуально-программная копия документа расположенного по адресу URL1 и сохраненная в файл, имеет: квалифицированную, усовершенствованную (подтверждены: метки времени, валидность сертификата), открепленную ЭЦП (приложена к данному файлу), что может быть использовано для подтверждения содержания и факта существования документа в этот момент времени. Права на данный скриншот принадлежат администрации Ask3.ru, использование в качестве доказательства только с письменного разрешения правообладателя скриншота. Администрация Ask3.ru не несет ответственности за информацию размещенную на данном скриншоте. Права на прочие зарегистрированные элементы любого права, изображенные на снимках принадлежат их владельцам. Качество перевода предоставляется как есть. Любые претензии, иски не могут быть предъявлены. Если вы не согласны с любым пунктом перечисленным выше, вы не можете использовать данный сайт и информация размещенную на нем (сайте/странице), немедленно покиньте данный сайт. В случае нарушения любого пункта перечисленного выше, штраф 55! (Пятьдесят пять факториал, Денежную единицу (имеющую самостоятельную стоимость) можете выбрать самостоятельно, выплаичвается товарами в течение 7 дней с момента нарушения.)