Рибосомный дисплей
Рибосомный дисплей — это метод, используемый для осуществления in vitro эволюции белков с целью создания белков, которые могут связываться с желаемым лигандом . В результате этого процесса образуются транслированные белки, которые связаны с их предшественником мРНК , который используется в виде комплекса для связывания с иммобилизованным лигандом на этапе селекции. Гибриды мРНК-белок, которые хорошо связываются, затем подвергаются обратной транскрипции в кДНК и их последовательность амплифицируется посредством ПЦР . [1] В результате получается нуклеотидная последовательность, которую можно использовать для создания прочносвязывающих белков.
Процесс отображения рибосомы
[ редактировать ]Дисплей рибосом начинается с нативной библиотеки последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды. [2] Каждая последовательность транскрибируется, а затем транслируется in vitro в полипептид. Однако библиотека ДНК, кодирующая конкретную библиотеку связывающих белков, генетически слита со спейсерной последовательностью, лишенной стоп-кодона на ее конце. Отсутствие стоп-кодона предотвращает связывание факторов высвобождения и запуск разборки трансляционного комплекса. Таким образом, эта спейсерная последовательность остается прикрепленной к пептидил-тРНК и занимает рибосомальный туннель и, таким образом, позволяет интересующему белку выступать из рибосомы и сворачиваться. В результате образуется комплекс мРНК, рибосомы и белка, который может связываться с поверхностно-связанным лигандом. Этот комплекс стабилизируется понижением температуры и добавлением катионов, таких как Mg. 2+ .
На последующих стадиях связывания или пэннинга комплекс вводится в связанный с поверхностью лиганд. Этого можно добиться несколькими способами, например, используя колонку для аффинной хроматографии со слоем смолы, содержащей лиганд, 96-луночный планшет с иммобилизованным, связанным с поверхностью лигандом, или магнитные шарики, покрытые лигандом. Комплексы, которые хорошо связываются, иммобилизуются. Последующее элюирование связующих с помощью высоких концентраций соли, хелатирующих агентов или мобильных лигандов, образующих комплекс со связывающим мотивом белка, позволяет диссоциировать мРНК. Затем мРНК можно обратно транскрибировать обратно в кДНК, подвергнуть мутагенезу и итеративно вводить в процесс с большим селективным давлением для выделения еще лучших связывающих веществ.
Преимущества рибосомного дисплея
[ редактировать ]Благодаря тому, что белок-предшественник присоединен к комплексу, процессы рибосомного дисплея пропускают разделение последовательностей на микрочипах /пептидных шариках/множественных лунках, которое часто встречается в анализах, включающих гибридизацию нуклеотидов , и обеспечивает готовый способ амплификации белков, которые действительно связываются, без расшифровки последовательность до тех пор, пока это не потребуется. В то же время этот метод основан на создании больших, концентрированных пулов разнообразия последовательностей без пробелов и предотвращении деградации этих последовательностей, гибридизации и реакции друг с другом способами, которые могли бы создать пробелы в пространстве последовательностей.
Он имеет успешный опыт разработки антител. [3] и протеиновые терапевтические [4] лидирует и до сих пор широко используется в этих областях.
Конкурирующими методами эволюции белков in vitro являются фаговый дисплей , дрожжевой дисплей , бактериальный дисплей и мРНК-дисплей . [5] пептиды (Маттеакис, Бхатт и Доу). Поскольку этот метод проводится полностью in vitro, он имеет два основных преимущества перед другими технологиями селекции. Во-первых, разнообразие библиотеки не ограничивается эффективностью трансформации бактериальных клеток, а только количеством рибосом и различных молекул мРНК, присутствующих в пробирке. Во-вторых, случайные мутации могут быть легко введены после каждого раунда отбора, поскольку ни одна библиотека не должна трансформироваться после какого-либо этапа диверсификации. Это обеспечивает легкую направленную эволюцию связывающих белков в течение нескольких поколений.
Обязательным условием отбора белков из библиотек является сопряжение генотипа (РНК, ДНК) и фенотипа (белка). При рибосомном дисплее эта связь осуществляется во время трансляции in vitro путем стабилизации комплекса, состоящего из рибосомы, мРНК и образующегося правильно свернутого полипептида. Рибосомальным комплексам позволяют связываться с иммобилизованной на поверхности мишенью. В то время как несвязанные комплексы вымываются, мРНК комплексов, отображающих связывающий полипептид, может быть восстановлена, и, таким образом, генетическая информация связывающих полипептидов доступна для анализа.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- Ханес, Дж.; Плюктун, А. (1997). «Отбор и эволюция функциональных белков in vitro с использованием рибосомного дисплея» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 94 (10): 4937–42. дои : 10.1073/pnas.94.10.4937 . ПМК 24609 . ПМИД 9144168 .
- Липовсек, Д.; Плюктун, А. (2004). «Эволюция белков in vitro с помощью рибосомного дисплея и дисплея мРНК». Дж. Иммунол. Методы . 290 (1–2): 51–67. дои : 10.1016/j.jim.2004.04.008 . ПМИД 15261571 .
- Он, М.; Тауссиг, М. (2007). «Эукариотический рибосомный дисплей с восстановлением ДНК in situ». Природные методы . 4 (3): 281–288. дои : 10.1038/nmeth1001 . ПМИД 17327849 . S2CID 7293661 .
- ^ Х Ян; Цзы Сюй (2006). «Технология рибосомного дисплея: приложения для направленной эволюции функциональных белков». Открытие наркотиков сегодня . 11 (19–20): 911–916. дои : 10.1016/j.drudis.2006.08.012 . ПМИД 16997141 .
- ^ Л. К. Маттеакис; Р. Р. Бхатт и У. Дж. Дауэр (сентябрь 1994 г.). «Система отображения полисом in vitro для идентификации лигандов из очень больших пептидных библиотек» . Труды Национальной академии наук . 91 (19): 9022–6. дои : 10.1073/pnas.91.19.9022 . ПМЦ 44739 . ПМИД 7522328 .
- ^ Джермутус, Лутц; Онеггер, Аннемари; Швезингер, Фальк; Ханес, Йозеф; Плюктун, Андреас (2 января 2001 г.). «Адаптация эволюции in vitro к сродству или стабильности белка» . Труды Национальной академии наук . 98 (1): 75–80. дои : 10.1073/pnas.98.1.75 . ISSN 0027-8424 . ПМК 14547 . ПМИД 11134506 .
- ^ Бьюкенен, Эндрю; Ферраро, Франко; Раст, Стивен; Шридхаран, Судхаршан; Фрэнкс, Рут; Дин, Грег; МакКорт, Мэтью; Джермутус, Лутц; Минтер, Ральф (31 августа 2012 г.). «Улучшение лекарственных свойств терапевтических белков путем направленной эволюции» . Инженерный дизайн и отбор белков . 25 (10): 631–638. дои : 10.1093/протеин/gzs054 . ISSN 1741-0126 . ПМЦ 3449403 . ПМИД 22942395 .
- ^ Цзин Д., Ли Ф, Цзян М., Цай Дж., Ву Ю, Се К., Ву Икс, Тан С., Лю Дж., Го В., Шэнь Г., Луо Е (ноябрь 2013 г.). «Импульсные электромагнитные поля улучшают микроструктуру и прочность костей у крыс с удаленными яичниками» . ПЛОС ОДИН . 8 (11): e79377. дои : 10.1371/journal.pone.0079377 . ПМЦ 3828367 . ПМИД 24244491 .