Белковые методы

Информацию о методах с ДНК или РНК см. в разделе «Методы нуклеиновых кислот» .

Белковые методы — это методы, используемые для изучения белков . Существуют экспериментальные методы изучения белков (например, для обнаружения белков, выделения и очистки белков, а также для характеристики структуры и функции белков, часто требующие предварительной очистки белка). Вычислительные методы обычно используют компьютерные программы для анализа белков. Однако многие экспериментальные методы (например, масс-спектрометрия ) требуют компьютерного анализа необработанных данных.

Генетические методы

Экспериментальный анализ белков обычно требует экспрессии и очистки белков. Экспрессия достигается путем манипулирования ДНК, которая кодирует интересующий белок(ы). Следовательно, анализ белков обычно требует методов ДНК, особенно клонирования . Некоторые примеры генетических методов включают концептуальную трансляцию, сайт-направленный мутагенез , использование слитого белка и сопоставление аллелей с болезненными состояниями. Некоторые белки никогда не секвенировались напрямую, однако путем перевода кодонов из известных последовательностей мРНК в аминокислоты методом, известным как концептуальная трансляция. (См. генетический код .) Сайт-направленный мутагенез избирательно вводит мутации, которые изменяют структуру белка. Функцию частей белков можно лучше понять, изучая изменение фенотипа в результате этого изменения. Слитые белки создаются путем вставки белковых меток, таких как His-tag , для получения модифицированного белка, который легче отслеживать. Примером этого может быть GFP-Snf2H, который состоит из белка, связанного с зеленый флуоресцентный белок с образованием гибридного белка. ДНК Путем анализа аллелей можно определить, что они связаны с болезненными состояниями, например, при расчете показателей LOD .

Экстракция белка из тканей

Экстракция белка из тканей с жестким внеклеточным матриксом (например, образцы биопсии, венозные ткани, хрящи, кожа) часто достигается в лабораторных условиях путем ударного распыления в жидком азоте. Образцы замораживают в жидком азоте и затем подвергают ударному или механическому измельчению. Поскольку при такой температуре вода в образцах становится очень хрупкой, образцы часто превращаются в скопление мелких фрагментов, которые затем можно растворить для экстракции белка. Для этой цели иногда используются устройства из нержавеющей стали, известные как измельчители тканей.

К преимуществам этих устройств относятся высокие уровни экстракции белка из небольших ценных образцов, к недостаткам – низкий уровень перекрестного загрязнения.

Очистка белка

• Выделение белка
  • Методы хроматографии: ионообменная , эксклюзионная хроматография (или гель-фильтрация) , аффинная хроматография.
• Экстракция и солюбилизация белка
• Концентрирующие белковые растворы
• Гель-электрофорез
  • Гель-электрофорез в денатурирующих условиях
  • Гель-электрофорез в неденатурирующих условиях
  • 2D гель-электрофорез
• Электрофокусировка

Обнаружение белков

Значительно малый размер белковых макромолекул особенно затрудняет идентификацию и количественную оценку неизвестных образцов белка. Для упрощения этого процесса было разработано несколько надежных методов количественного определения белка. Эти методы включают метод Варбурга – Кристиана , анализ Лоури и анализ Брэдфорда (все из которых основаны на поглощающих свойствах макромолекул).

В методе анализа Брэдфорда используется краситель для связывания с белком. Чаще всего Кумасси бриллиантовый синий используется краситель G-250. В отсутствие белка краситель имеет красный цвет, но, связавшись с белком, он становится синим. Комплекс краситель-белок поглощает свет максимально на длине волны 595 нанометров и чувствителен к образцам, содержащим от 1 до 60 мкг. В отличие от методов Лоури и Варбурга-Кристиан, анализы Брэдфорда не полагаются на содержание триптофана и тирозина в белках, что гипотетически позволяет методу быть более точным.

Анализ Лоури похож на анализ биурета, но в нем используется реагент Фолина, который более точен для количественного определения. Реактив Фолина стабилен только в кислых условиях, и метод подвержен искажению результатов в зависимости от того, сколько триптофана и тирозина присутствует в исследуемом белке. Реагент Фолина связывается с триптофаном и тирозином, а это означает, что концентрация двух аминокислот влияет на чувствительность метода. Этот метод чувствителен в диапазонах концентраций, аналогичных методу Брэдфорда, но требует незначительного увеличения количества белка.

Метод Варбурга-Кристиан проверяет белки в их естественном диапазоне поглощения. Большинство белков очень хорошо поглощают свет с длиной волны 280 нанометров благодаря наличию триптофана и тирозина, но этот метод чувствителен к разным количествам аминокислот, на которых он основан.

Ниже перечислены дополнительные методы, которые связаны с более подробными описаниями соответствующих методов.

Неспецифические методы, позволяющие обнаружить только общий белок

• Поглощение : Считайте при 280 или 215 нм. Может быть очень неточным. Обнаружение в диапазоне от 100 мкг/мл до 1 мг/мл. Соотношение показателей поглощения, полученных при 260/280, может указывать на чистоту/загрязнение образца (чистые образцы имеют соотношение <0,8).
• Анализ белка по Брэдфорду : обнаружение в диапазоне ~1 мг/мл.
• Анализы на основе биуретового теста :
  • Анализ бицинхониновой кислоты (анализ BCA) : обнаружение до 0,5 мкг/мл.
  • Анализ белка Лоури : обнаружение в диапазоне 0,01–1,0 мг/мл.
• Флуорескамин : определяет количество белков и пептидов в растворе, если в аминокислотах присутствует первичный амин.
• Амидо черный : обнаружение в диапазоне 1–12 мкг/мл.
• Коллоидное золото : обнаружение в диапазоне 20–640 нг/мл.
• Обнаружение азота :
  • Метод Кьельдаля : используется в основном для пищевых продуктов и требует окисления материала.
  • Метод Дюма : используется в основном для пищевых продуктов и требует сжигания материала.

Конкретные методы, позволяющие определить количество одного белка

• Спектрометрические методы :
  • Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) : метод хроматографии для обнаружения белков или пептидов.
  • Жидкостная хроматография-масс-спектрометрия (ЖХ/МС) : может обнаруживать белки в низких концентрациях (от нг/мл до пг/мл) в крови и жидкостях организма, например, для фармакокинетики .
• Антителозависимые методы:
  • Иммуноферментный анализ ( ИФА ): позволяет обнаружить белок вплоть до пг/мл.
  • Иммунопреципитация белка : метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антитела, которое специфически связывается с этим конкретным белком.
  • Иммуноэлектрофорез : разделение и характеристика белков на основе электрофореза и реакции с антителами.
  • Вестерн-блоттинг : сочетает гель-электрофорез и инкубацию с антителами для обнаружения специфических белков в образце гомогената или экстракта ткани (разновидность метода иммуноэлектрофореза ).
  • Иммуноокрашивание белков

Белковые структуры

• Рентгеновская кристаллография
• ЯМР белков
• Криоэлектронная микроскопия
• Малоугловое рассеяние рентгеновских лучей
• Круговой дихроизм

Взаимодействия с участием белков

• Белковый след

Белково-белковые взаимодействия

• (Дрожжевая) двухгибридная система
• Анализ комплементации белковых фрагментов
• Коиммунопреципитация
• Аффинная очистка и масс-спектрометрия
• Анализ бесконтактного лигирования
• Маркировка близости

Взаимодействия белок-ДНК

• Чип на чипе
• Чип-секвенирование
• ID дамбы
• Микромасштабный термофорез

Взаимодействия белок-РНК

• Анализ отпечатка пальцев
• TCP-последовательность

Вычислительные методы

• Молекулярная динамика
• Прогнозирование структуры белка
• Выравнивание последовательностей белков (сравнение последовательностей, включая BLAST )
• Структурное выравнивание белка
• Онтология белка (см. онтологию гена )

Другие методы

• Водородно-дейтериевый обмен
• Масс-спектрометрия
• Секвенирование белков
• Синтез белка
• Протеомика
• Снятие отпечатков пальцев пептидной массы
• Анализ связывания лигандов
• Восточный блоттинг
• Метаболическая маркировка
  • Маркировка тяжелыми изотопами
  • Маркировка радиоактивными изотопами

См. также

• CSH-протоколы
• Текущие протоколы

Библиография

• Дэниел М. Боллаг, Майкл Д. Розицки и Стюарт Дж. Эдельштейн. (1996.) Белковые методы , 2-е изд., Wiley Publishers. ISBN   0-471-11837-0 .