Бактериальный дисплей
Бактериальный дисплей (или бактериальный дисплей , или бактериальный поверхностный дисплей ) — это метод белковой инженерии, используемый для in vitro эволюции белков . Библиотеки полипептидов , представленных на поверхности бактерий, можно проверять с помощью проточной цитометрии или процедур итеративной селекции (биопэннинг). Этот метод белковой инженерии позволяет нам связать функцию белка с геном, который его кодирует. Бактериальный дисплей можно использовать для поиска целевых белков с желаемыми свойствами и для создания аффинных лигандов , специфичных для клеток. Эту систему можно использовать во многих приложениях, включая создание новых вакцин, идентификацию субстратов ферментов и определение сродства лиганда к его целевому белку.
Бактериальный дисплей часто сочетается с методами сортировки клеток, активируемой магнитом (MACS) или сортировкой клеток, активируемой флуоресценцией (FACS). Конкурирующими методами эволюции белков in vitro являются фаговый дисплей , рибосомный дисплей , дрожжевой дисплей и мРНК-дисплей . Бактериофаговый дисплей является наиболее распространенным типом используемой системы отображения. [1] хотя бактериальный дисплей становится все более популярным по мере решения технических проблем. Бактериальный дисплей в сочетании с FACS также имеет то преимущество, что это метод в реальном времени.
История
[ редактировать ]Системы клеточного дисплея были впервые использованы в 1985 году, когда пептиды были генетически слиты с белками, отображаемыми на бактериофаге М13 . Бактериофаговый дисплей — это широко используемая система клеточного дисплея, хотя она имеет ограничения по размеру отображаемых белков. Затем в 1986 году был представлен бактериальный дисплей, позволяющий отображать на поверхности более крупные белки. Системы бактериального отображения были впервые представлены Freudl et al. и Чарбит и др. в 1986 году, когда они использовали бактериальные поверхностные белки OmpA и LamB для отображения пептидов. Фрейдл и др. слитые пептиды с линкерами с геном ompA , вызывающие экспрессию пептидов в белках OmpA. Они показали, что теперь белки подвергаются расщеплению К. протеиназой Таким образом, вставленные пептиды, не относящиеся к OmpA, были мишенью протеиназы К. Введение чужеродных пептидов не влияло на рост бактериальных клеток. Чарбит и др. сначала определили области белка LamB, которые были «разрешены» для вставки чужеродных петидов ( т.е. которые не приводили к полной потере функциональности белка). Затем они исследовали универсальность разрешительных участков (предел по размеру, природа эпитопа...), которые все были расположены в открытых на поверхности петлях тримерного порина внешней мембраны, с целью разработки мультивалентных живых бактериальных вакцин (12-15 ). Это было первое свидетельство использования методов бактериальной поверхности для экспрессии белков на поверхности клеток без изменения функции клетки. [2]
Принцип
[ редактировать ]Пептиды очень полезны как терапевтические и диагностические вещества. Их использование становится все более популярным, а системы отображения предлагают полезный способ создания пептидов и оптимизации их связывающих способностей. Клетки экспрессируют поверхностные белки, которые могут участвовать в целом ряде реакций, включая распознавание других клеток, взаимодействие с другими клетками и передачу сигналов клетками . Многие типы бактерий имеют белки клеточной поверхности, такие как энтеропатогенный E. coli белок интимин , который участвует в связывании с клетками-хозяевами, или белок OmpA клеток E. coli , который важен для сохранения структуры внешней мембраны . [3] Многие поверхностные белки участвуют в прикреплении бактериальных клеток и инвазии в клетку-хозяина. С помощью бактериального дисплея можно идентифицировать целевые белки в клетке-хозяине. Эти поверхностные белки сначала необходимо перенести через мембраны бактериальных клеток из цитоплазмы на поверхность клетки. Грамотрицательные бактерии имеют дополнительное периплазматическое пространство , которого нет у грамположительных бактерий , поэтому им приходится сложнее перемещать белки. Для отображения гетерологичных белков на поверхности бактериальных клеток обычно требуется слияние белка с поверхностным белком, называемым каркасом.
Строительные леса
[ редактировать ]Каркасы используются для отображения гетерологичного белка на поверхности бактериальных клеток. Использовались различные каркасы, такие как белки внешней мембраны, белки фимбрии/жгутиков и CPX (циркулярно перестановленный OmpX). [4] Каркас CPX обеспечивает слияние пептидов на обоих концах каркаса.
OMP являются обычными каркасами для бактериального дисплея. Белки также могут отображаться на поверхности бактериальных клеток с помощью автотранспортеров. Автотранспортеры являются частью системы секреции типа V. Обычно они имеют три домена: лидерную последовательность на N-конце; центральный пассажирский отсек; автотранспортерный домен на С-конце. Гетерологичный белок встраивают в пассажирский домен. [5] Другой метод слияния гетерологичных белков — слияние с фимбриями / жгутиками , которые представляют собой нитевидные выступы на поверхности клетки. В основном грамотрицательные бактерии имеют множество фимбрии, поэтому отображение белков на фимбриях имеет преимущество перед некоторыми другими поверхностными белками, которые менее многочисленны. Недостатком использования фимбрий является то, что существует относительно небольшой предел размера вставки - 10-30 аминокислот . [6]
После того как гетерологичный белок слит с белком поверхности бактериальной клетки, он подвергается воздействию либо фермента , либо клетки (экспрессирующей целевой белок), либо антитела (обычно с флуоресцентной меткой ), в зависимости от применения эксперимента. Затем во время FACS образец пропускают через луч света в очень узком потоке жидкости, так что одновременно может проходить только одна клетка, и регистрируется испускаемая флуоресценция. Информацию о размере клетки можно получить путем рассеяния света, и если произошло связывание гетерологичного белка с целевым белком/клеткой, будет излучаться больше флуоресценции.
Приложения
[ редактировать ]Бактериальный поверхностный дисплей можно использовать для различных целей. К ним относятся скрининг на основе аффинности, картирование эпитопов антител , идентификация пептидных субстратов, идентификация клеточно-связывающих пептидов и создание вакцин. [7]
Скрининг на основе сходства
[ редактировать ]Скрининг используется для определения очевидного сродства гетерологичных белков, присутствующих на поверхности бактериальных клеток, к белкам-мишеням. Этот метод обычно комбинируется с FACS, и добавление нефлуоресцентного конкурента целевого белка полезно для получения более точных аффинностей связывания. Добавление конкурента снижает вероятность повторного связывания целевых белков, что может сделать аффинность связывания менее точной.
Циклические пептидные связыватели Скрининг
[ редактировать ]Циклические пептиды могут успешно экспонироваться на поверхности бактериальных клеток. [8] Путем рандомизации ДНК миллионы циклических пептидов, представленных на поверхности клеток, можно проверить на белок-мишень с использованием высокопроизводительного FACS. [9]
Картирование эпитопов антител
[ редактировать ]Картирование эпитопов антител используется для определения специфичности антитела. Эпитоп . (сайт связывания антител с антигенами) экспрессируется на поверхности бактериальных клеток путем экспрессии участка гена, кодирующего антиген Проточная цитометрия с флуоресцентно меченными антителами используется для определения количества антител, связывающихся с эпитопом. [10]
Идентификация пептидных субстратов
[ редактировать ]Это можно применить для поиска лучших субстратов для протеолитических ферментов . Субстрат отображается на поверхности бактериальных клеток между аффинным лигандом и каркасом, а кинетика протеолиза субстрата измеряется с помощью FACS.
Идентификация клеточно-связывающих пептидов
[ редактировать ]Бактериальный дисплей можно использовать для обнаружения пептидов, которые связываются со специфическими клетками, например, клетками рака молочной железы или стволовыми клетками . Представленные белки флуоресцентно помечены GFP , поэтому взаимодействия связывания между пептидами и клетками-мишенями можно увидеть с помощью проточной цитометрии. Контрольные образцы необходимы для измерения уровней флуоресценции в отсутствие отображаемых пептидов. Также необходимы образцы, которые не содержат отображаемых пептидов, но содержат клетки млекопитающих и бактериальные клетки (включая каркас).
Доставка вакцины
[ редактировать ]Доставка вакцины является очень распространенным применением бактериального поверхностного дисплея. Существует два типа живых бактериальных вакцин:
- Обычно патогенные бактерии ослабляются и перестают быть патогенными.
- Комменсальные или пищевые бактерии, которые не являются патогенными.
Использование бактериального поверхностного дисплея антигенов является ценной альтернативой традиционной разработке вакцин по разным причинам, одна из которых заключается в том, что белки, экспрессируемые на поверхности бактериальных клеток, могут действовать в качестве адъюванта . Обычные вакцины требуют добавления адъювантов. Еще одним преимуществом создания вакцин с использованием систем бактериального дисплея является то, что в живую вакцину можно включить целую бактериальную клетку. [11] В отличие от систем бактериофагового дисплея, которые обычно используются при разработке вакцин для поиска неизвестных эпитопов, системы бактериального дисплея используются для экспрессии известных эпитопов, а клетки действуют как система доставки вакцины. [12]
Сравнение с фаговым дисплеем
[ редактировать ], отображаемых бактериями, В аналогичных условиях отбор пептидов для моделирования белка стрептавидина оказался хуже. [13]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Кенрик С.А., Догерти П.С. (2010). «Бактериальный дисплей обеспечивает эффективное и количественное созревание сродства к пептидам» . Протеин Eng Des Sel . 23 (1): 9–17. дои : 10.1093/протеин/gzp065 . ПМК 2791049 . ПМИД 19903738 .
- ^ Фрейдл Р., Макинтайр С., Деген М., Хеннинг У. (1986). «Воздействие на клеточную поверхность белка OmpA внешней мембраны Escherichia coli K-12». Дж Мол Биол . 188 (3): 491–4. дои : 10.1016/0022-2836(86)90171-3 . ПМИД 3525847 .
- ^ Ван Ю (2002). «Функция OmpA в Escherichia coli». Биохимия Биофиз Рес Коммьюнити . 292 (2): 396–401. дои : 10.1006/bbrc.2002.6657 . ПМИД 11906175 .
- ^ Гетц Дж.А., Шоп Т.Д., Догерти П.С. (2012). «Открытие пептидов с использованием бактериального дисплея и проточной цитометрии». Белковая инженерия в терапии, Часть B. Методы энзимологии. Том. 503. С. 75–97. дои : 10.1016/B978-0-12-396962-0.00004-5 . ISBN 9780123969620 . ПМИД 22230566 .
- ^ Вернерус Х., Шталь С. (2004). «Биотехнологическое применение поверхностно-инженерных бактерий». Биотехнология Appl Biochem . 40 (Часть 3): 209–28. дои : 10.1042/BA20040014 . ПМИД 15035661 . S2CID 9395029 .
- ^ Клемм П., Шембри М.А. (2000). «Бактериальные адгезины: функции и структура». Int J Med Microbiol . 290 (1): 27–35. дои : 10.1016/S1438-4221(00)80102-2 . ПМИД 11043979 .
- ^ Догерти PS (2007). «Белковая инженерия с бактериальным дисплеем». Curr Opin Struct Biol . 17 (4): 474–80. дои : 10.1016/j.sbi.2007.07.004 . ПМИД 17728126 .
- ^ Палей, Шубхенду; Бехер, Кира С.; Нинберг, Кристиан; Хосе, Иоахим; Моотц, Хеннинг Д. (2 января 2019 г.). «Бактериальный дисплей полусинтетических циклических пептидов на клеточной поверхности» . ХимБиоХим . 20 (1): 72–77. дои : 10.1002/cbic.201800552 . ISSN 1439-4227 . ПМИД 30216604 . S2CID 52277462 .
- ^ Палей, Шубхенду; Хосе, Иоахим; Моотц, Хеннинг Д. (2022), Коппок, Мэтью Б.; Винтон, Александр Дж. (ред.), «Получение полусинтетических циклических пептидов, отображаемых на поверхности бактериальных клеток» , «Пептидные макроциклы» , «Методы молекулярной биологии», том. 2371, Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Springer US, стр. 193–213, doi : 10.1007/978-1-0716-1689-5_11 , ISBN. 978-1-0716-1688-8 , PMID 34596850 , S2CID 238237296 , получено 12 мая 2022 г.
- ^ Рокберг Дж., Лофблом Дж., Хьельм Б., Улен М., Шталь С. (2008). «Картирование эпитопов антител с использованием бактериального поверхностного дисплея». Природные методы . 5 (12): 1039–45. дои : 10.1038/nmeth.1272 . ПМИД 19029907 . S2CID 12078882 .
- ^ Вестерлунд-Викстрем Б (2000). «Отображение пептидов на бактериальных жгутиках: принципы и применение». Int J Med Microbiol . 290 (3): 223–30. дои : 10.1016/S1438-4221(00)80119-8 . ПМИД 10959724 .
- ^ Бенхар I (2001). «Биотехнологическое применение фагового и клеточного дисплея». Достижения биотехнологии . 19 (1): 1–33. дои : 10.1016/S0734-9750(00)00054-9 . ПМИД 14538090 .
- ^ Лундер и др. (2005). «Сравнение библиотек пептидов бактериального и фагового дисплея в поисках мотива связывания с мишенью». Прикладная биохимия и биотехнология . 127 (2): 125–131. дои : 10.1385/ABAB:127:2:125 . ПМИД 16258189 . S2CID 45243314 .
12. Чарбит А., Булен Дж. К., Райтер А., Хофнунг М. Исследование топологии бактериального мембранного белка путем генетической вставки чужеродного эпитопа; экспрессия на поверхности клетки. EMBO J. 1986, ноябрь;5(11):3029-37.
13. Чарбит А., Собчак Э., Мишель М.Л., Молла А., Тиоллайс П., Хофнунг М. Презентация двух эпитопов региона preS2 вируса гепатита B на живых рекомбинантных бактериях. Дж Иммунол. 1 сентября 1987 г.; 139 (5): 1658-64.
14. Чарбит А., Молла А., Саурин В., Хофнунг М. Универсальность вектора для экспрессии чужеродных полипептидов на поверхности грамотрицательных бактерий. Ген. 15 октября 1988 г.;70(1):181-9.
15. Ньютон С.М., Клебба П.Е., Мишель В., Хофнунг М., Чарбит А. Топология мембранного белка LamB путем мечения эпитопа и сравнение с рентгеновской моделью. J Бактериол. Июнь 1996 г.; 178 (12): 3447-56.