Протеиназа К
| Протеиназа К | |||
|---|---|---|---|
 Структура протеиназы К. [1] | |||
| Идентификаторы | |||
| Номер ЕС. | 3.4.21.64 | ||
| Базы данных | |||
| ИнтЭнк | вид IntEnz | ||
| БРЕНДА | БРЕНДА запись | ||
| Экспаси | Просмотр NiceZyme | ||
| КЕГГ | КЕГГ запись | ||
| МетаЦик | метаболический путь | ||
| ПРЯМОЙ | профиль | ||
| PDB Структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||
| |||
| Протеиназа К | |||
|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||
| Организм | |||
| Символ | PROK | ||
| ЮниПрот | P06873 | ||
| |||
В молекулярной биологии протеиназа K ( EC 3.4.21.64 , протеаза K , эндопептидаза K , щелочная протеиназа Tritirachium , сериновая протеиназа Tritirachium album , протеиназа K Tritirachium album широкого спектра действия ) представляет собой сериновую протеазу . [2] [3] [4] Фермент ( был обнаружен в 1974 году в экстрактах гриба Parengyodontium album ранее Engyodontium album или Tritirachium album ). [5] Протеиназа К способна переваривать волосы ( кератин ), отсюда и название «Протеиназа К». Преимущественным местом расщепления является пептидная связь, примыкающая к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот с блокированными альфа -аминогруппами . Он широко используется из-за своей широкой специфичности. Этот фермент принадлежит к семейству пептидаз S8 ( субтилизин ). Молекулярная масса протеиназы К составляет 28 900 дальтон (28,9 кДа).
Ферментативная активность
[ редактировать ]Активируемый кальцием, фермент переваривает белки преимущественно после гидрофобных аминокислот (алифатических, ароматических и других гидрофобных аминокислот). Хотя ионы кальция не влияют на активность фермента, они способствуют его стабильности.Белки будут полностью переварены, если время инкубации длительное и концентрация протеазы достаточно высока. При удалении ионов кальция стабильность фермента снижается, но протеолитическая активность сохраняется. [6] Протеиназа К имеет два сайта связывания Ca. 2+ , которые расположены близко к активному центру, но не принимают непосредственного участия в каталитическом механизме. Остаточная активность достаточна для переваривания белков, которые обычно загрязняют препараты нуклеиновых кислот. Поэтому расщепление протеиназой К для очистки нуклеиновых кислот обычно проводят в присутствии ЭДТА (ингибирование ионов металлов-зависимых ферментов, таких как нуклеазы).
Протеиназа К также стабильна в широком диапазоне pH (4–12) с оптимумом pH 8,0. [5] Повышение температуры реакции с 37 °С до 50–60 °С может повысить активность в несколько раз, например, добавление 0,5–1% додецилсульфата натрия (ДСН) или хлорида гуанидиния (3 М), тиоцианата гуанидиния (1 М). ) и мочевина (4 М) [ оспаривается (по причине: не указан источник температуры) – обсудить ] . Вышеупомянутые условия усиливают активность протеиназы К, делая более доступными сайты расщепления ее субстрата. При температуре выше 65 °C трихлоруксусная кислота (TCA) или ингибиторы сериновой протеазы AEBSF , PMSF или DFP ингибируют активность. Протеиназа К не ингибируется гуанидинхлоридом , тиоцианатом гуанидиния , мочевиной , саркозилом , тритоном X-100 , твином 20 , SDS , цитратом , йодуксусной кислотой , ЭДТА или другими ингибиторами сериновой протеазы, такими как Nα-Tosyl-Lys хлорметилкетон (TLCK). и Nα-тозил-Phe хлорметилкетон (TPCK) [ нужна ссылка ] .
Активность протеазы К в обычно используемых буферах [7]
| Буфер (pH = 8,0, 50 °C, 1,25 мкг/мл протеазы К, инкубация 15 мин) | Активность протеиназы К (%) |
|---|---|
| 30 мМ Трис·Cl | 100 |
| 30 мМ Трис·Cl; 30 мМ ЭДТА; 5% Твин 20 ; 0,5% Тритон Х-100 ; 800 мМ GuHCl | 313 |
| 36 мМ Трис·Cl; 36 мМ ЭДТА; 5% Твин 20 ; 0,36% Тритон Х-100 ; 735 мМ GuHCl | 301 |
| 10 мМ Трис·Cl; 25 мМ ЭДТА; 100 мМ NaCl; 0,5% ДСН | 128 |
| 10 мМ Трис·Cl; 100 мМ ЭДТА; 20 мМ NaCl; 1% Саркосил | 74 |
| 10 мМ Трис·Cl; 50 мМ КСl; 1,5 мМ MgCl 2 ; 0,45% Твин 20 ; 0,5% Тритон Х-100 | 106 |
| 10 мМ Трис·Cl; 100 мМ ЭДТА; 0,5% ДСН | 120 |
| 30 мМ Трис·Cl; 10 мМ ЭДТА; 1% паспорт безопасности | 203 |
Приложения
[ редактировать ]Протеиназа К обычно используется в молекулярной биологии для переваривания белка и удаления загрязнений из препаратов нуклеиновой кислоты . Добавление протеиназы К к препаратам нуклеиновых кислот быстро инактивирует нуклеазы , которые в противном случае могли бы разрушить ДНК или РНК во время очистки. Он очень подходит для этого применения, поскольку фермент активен в присутствии химических веществ, денатурирующих белки, таких как SDS и мочевина , хелатирующих агентов, таких как ЭДТА , сульфгидрильные реагенты, а также трипсина или химотрипсина ингибиторы . Протеиназа К используется для разрушения белков в лизатах клеток (тканей, клеток культур клеток) и для высвобождения нуклеиновых кислот, поскольку она очень эффективно инактивирует ДНКазы и РНКазы. Несколько примеров приложений: Протеиназа К очень полезна для выделения высоконативных, неповрежденных ДНК или РНК, поскольку большинство ДНКаз и РНКаз микробов или млекопитающих быстро инактивируются ферментом, особенно в присутствии 0,5–1% SDS.
Активность фермента по отношению к нативным белкам стимулируется денатурантами, такими как ДСН. Напротив, при измерении с использованием пептидных субстратов денатуранты ингибируют фермент. Причиной такого результата является то, что денатурирующие агенты разворачивают белковые субстраты и делают их более доступными для протеазы. [8]
Ингибиторы
[ редактировать ]Протеиназа К имеет две дисульфидные связи: [9] но он проявляет более высокую протеолитическую активность в присутствии восстановителей (например, 5 мМ ДТТ ), [10] предполагая, что предполагаемое восстановление собственных дисульфидных связей не приводит к его необратимой инактивации. Протеиназа К ингибируется ингибиторами сериновой протеазы, такими как фенилметилсульфонилфторид ( PMSF ), диизопропилфторфосфат ( DFP ) или 4-(2-аминоэтил)бензолсульфонилфторид ( AEBSF ). На активность протеиназы К не влияют реагенты, модифицирующие сульфгидрил: пара-хлормеркурибензойная кислота ( PCMB ), N-альфа-тозил-L-лизилхлорметилкетон ( TLCK ) или N-альфа-тозил-1-фенилаланин-хлорметилкетон ( TPCK) . ), [10] хотя предположительно, если бы эти реагенты были включены вместе с реагентами, восстанавливающими дисульфид, которые обнажили обычно недоступные тиолы протеиназы К, они могли бы затем ингибироваться.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Бетцель С., Сингх Т.П., Висанджи М., Питерс К., Фитткау С., Сенгер В., Уилсон К.С. (июль 1993 г.). «Структура комплекса протеиназы К с аналогом субстрата-ингибитором гексапептида при разрешении 2,2-А» . Ж. Биол. Хим . 268 (21): 15854–8. дои : 10.1016/S0021-9258(18)82332-8 . ПМИД 8340410 .
- ^ Морихара К., Цузуки Х (1975). «Специфичность протеиназы К из Tritirachium album Limber для синтетических пептидов» . Сельское хозяйство. Биол. Хим . 39 (7): 1489–1492. дои : 10.1271/bbb1961.39.1489 .
- ^ Краус Э., Килц Х.Х., Фемферт У.Ф. (февраль 1976 г.). «Специфичность протеиназы К в отношении окисленной B-цепи инсулина». З. Физиол Хоппе-Зейлера. Хим . 357 (2): 233–7. ПМИД 943367 .
- ^ Яни К.Д., Ледерер Г., Майер Б. (1986). «Аминокислотная последовательность протеиназы К плесени Tritirachium album Limber» . ФЭБС Летт . 199 (2): 139–144. дои : 10.1016/0014-5793(86)80467-7 . S2CID 85577597 .
- ^ Jump up to: а б Эбелинг В., Хенрих Н., Клоков М., Мец Х., Орт Х.Д., Ланг Х. (август 1974 г.). «Протеиназа К из альбома Tritirachium Limber» . Евро. Дж. Биохим . 47 (1): 91–7. дои : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x . ПМИД 4373242 .
- ^ Мюллер А., Хинрикс В., Вольф В.М., Сенгер В. (сентябрь 1994 г.). «Кристаллическая структура безкальциевой протеиназы К с разрешением 1,5 А». Ж. Биол. Хим . 269 (37): 23108–11. дои : 10.2210/pdb2pkc/pdb . ПМИД 8083213 .
- ^ Ag-Scientific. «Часто задаваемые вопросы о протеиназе К» . Архивировано из оригинала 17 октября 2020 года . Проверено 15 октября 2020 г.
- ^ Хильц Х., Вигерс У., Адамиц П. (1975). «Стимуляция действия протеиназы К денатурирующими агентами: применение для выделения нуклеиновых кислот и деградации «замаскированных» белков» . Европейский журнал биохимии . 56 (1): 103–108. дои : 10.1111/j.1432-1033.1975.tb02211.x . ПМИД 1236799 .
- ^ «ПРОК - предшественник протеиназы К - альбом Parengyodontium» . Унипрот . 11 декабря 2019 года. Архивировано из оригинала 19 ноября 2020 года . Проверено 7 февраля 2020 г.
- ^ Jump up to: а б «Протокол протеиназы K Novagen» (PDF) . Сигма Олдрич . 11 декабря 2019 г. Архивировано (PDF) из оригинала 6 июня 2024 г. . Проверено 7 февраля 2020 г.
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Руководство по ферментам протеиназы К Уортингтона
