Снятие отпечатков пальцев пептидной массы
Снятие отпечатков пальцев пептидной массы ( PMF ), также известное как дактилоскопия белков , представляет собой аналитический метод идентификации белка , при котором неизвестный интересующий белок сначала расщепляется на более мелкие пептиды , абсолютные массы которых можно точно измерить с помощью масс-спектрометра, такого как MALDI-TOF. или ESI-TOF . [1] Метод был разработан в 1993 году несколькими группами независимо. [2] [3] [4] [5] [6] Массы пептидов сравниваются либо с базой данных, содержащей известные последовательности белков, либо даже с геномом. Это достигается с помощью компьютерных программ, которые переводят известный геном организма в белки, затем теоретически разрезают белки на пептиды и вычисляют абсолютные массы пептидов из каждого белка. Затем они сравнивают массы пептидов неизвестного белка с теоретическими массами пептидов каждого белка, закодированного в геноме. Результаты статистически анализируются, чтобы найти лучшее совпадение.
Преимущество этого метода состоит в том, что необходимо знать только массы пептидов. Недостатком является то, что последовательность белка должна присутствовать в интересующей базе данных. Кроме того, большинство алгоритмов PMF предполагают, что пептиды происходят из одного белка. [7] Наличие смеси может существенно усложнить анализ и потенциально поставить под угрозу результаты. Типичным для идентификации белков на основе PMF является требование изолированного белка. Смеси, превышающие количество белков в 2–3, обычно требуют дополнительного использования идентификации белков на основе МС/МС для достижения достаточной специфичности идентификации. Таким образом, типичные образцы PMF представляют собой изолированные белки, полученные в результате двумерного гель-электрофореза (2D-гели) или изолированные SDS-PAGE полосы . Дополнительные анализы с помощью МС/МС могут быть либо прямыми, например, анализ MALDI-TOF/TOF, либо последующим анализом наноЖХ-ESI-MS/MS элюатов гелевых пятен. [7] [8]
Происхождение
[ редактировать ]Из-за долгого и утомительного процесса анализа белков был разработан массовый дактилоскопический анализ пептидов. Деградация по Эдману использовалась в анализе белков, и для анализа одного аминокислотного остатка требовалось почти час. [9] SDS-PAGE также использовался для разделения белков в очень сложных смесях, при этом также использовались методы электроблоттинга и окрашивания. [10] Затем полосы будут извлечены из геля и автоматически секвенированы. Постоянная проблема в этом процессе заключалась в том, что мешающие белки также очищались с интересующим белком. Последовательности этих мешающих белков были собраны в так называемую базу данных Дейхоффа. [11] В конечном итоге наличие последовательностей этих известных белковых примесей в базах данных сократило время работы приборов и затраты, связанные с анализом белков.
Подготовка проб
[ редактировать ]Образцы белка можно получить с помощью SDS-PAGE. [7] или обращенно-фазовой ВЭЖХ , а затем подвергаются некоторым химическим модификациям. Дисульфидные мостики в белках восстанавливаются, а аминокислоты цистеина химически карбамидометилируются или акриламидируются во время гель-электрофореза.
Затем белки разрезаются на несколько фрагментов с помощью протеолитических ферментов, таких как трипсин , химотрипсин или Glu-C . Типичное соотношение образец:протеаза составляет 50:1. Протеолиз обычно проводят в течение ночи, полученные пептиды экстрагируют ацетонитрилом и сушат в вакууме. Затем пептиды растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды или дополнительно концентрируют и очищают и готовы к масс-спектрометрическому анализу.
Масс-спектрометрический анализ
[ редактировать ]Переваренный белок можно анализировать с помощью масс-спектрометров различных типов, таких как ESI-TOF или MALDI-TOF . MALDI-TOF часто является предпочтительным инструментом, поскольку он обеспечивает высокую пропускную способность образцов и позволяет анализировать несколько белков в одном эксперименте, если он дополняется анализом MS/MS . ЖХ/ESI-MS и CE/ESI-MS также являются отличными методами для снятия отпечатков пальцев по массе пептидов. [12] [13]
Небольшая фракция пептида (обычно 1 микролитр или меньше) наносится пипеткой на мишень MALDI, и химическое вещество, называемое матрицей к смеси пептидов добавляется . Обычными матрицами являются синапиновая кислота , альфа-циано-4-гидроксикоричная кислота и 2,3-дигидроксибензойная кислота . Молекулы матрицы необходимы для десорбции молекул пептида. Молекулы матрицы и пептида сокристаллизуются на мишени MALDI и готовы к анализу. Существует один преимущественно метод подготовки проб MALDI-MS, а именно метод сухих капель. [14] Мишень вставляется в вакуумную камеру масс-спектрометра, и десорбция и ионизация полипептидных фрагментов инициируются импульсным лазерным лучом, который передает большое количество энергии молекулам матрицы. Переноса энергии достаточно, чтобы способствовать ионизации и переходу матричных молекул и пептидов из твердой фазы в газовую фазу. Ионы ускоряются в электрическом поле масс-спектрометра и летят к детектору ионов, где их прибытие фиксируется как электрический сигнал. Их отношение массы к заряду пропорционально времени их полета (TOF) в трубе дрейфа и может быть рассчитано соответствующим образом.
Сочетание ESI с капиллярной LC может отделить пептиды от белковых гидролизатов, одновременно получая их молекулярные массы. [15] Капиллярный электрофорез в сочетании с ESI-MS является еще одним методом; однако лучше всего он работает при анализе небольших количеств белков. [13]
Компьютерный анализ
[ редактировать ]Масс-спектрометрический анализ дает список молекулярных масс, который часто называют списком пиков. Массы пептидов сравниваются с базами данных белков, такими как Swissprot , которые содержат информацию о последовательностях белков. Программное обеспечение выполняет in silico анализ белков в базе данных с помощью того же фермента (например, трипсина), который используется в реакции химического расщепления. Затем рассчитывают массу этих пептидов и сравнивают со списком пиков измеренных масс. Результаты статистически анализируются, и возможные совпадения возвращаются в таблицу результатов.
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Клаузер К.Р., Бейкер П., Берлингейм А.Л. (1999). «Роль точного измерения массы (+/- 10 частей на миллион) в стратегиях идентификации белков с использованием МС или МС/МС и поиска в базе данных». Анальный. Хим . 71 (14): 2871–82. дои : 10.1021/ac9810516 . ПМИД 10424174 .
- ^ Паппин DJ, Ходжруп П., Блисби Эй Джей (1993). «Быстрая идентификация белков с помощью дактилоскопии пептидной массы». Курс. Биол . 3 (6): 327–32. Бибкод : 1993CBio....3..327P . дои : 10.1016/0960-9822(93)90195-Т . ПМИД 15335725 . S2CID 40203243 .
- ^ Хензель В.Дж., Биллечи Т.М., Стултс Дж.Т., Вонг С.К., Гримли С., Ватанабэ С. (1993). «Идентификация белков из двумерных гелей путем поиска молекулярной массы пептидных фрагментов в базах данных последовательностей белков» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 90 (11): 5011–5. Бибкод : 1993PNAS...90.5011H . дои : 10.1073/pnas.90.11.5011 . ПМК 46643 . ПМИД 8506346 .
- ^ Манн М., Хойруп П., Ропсторф П. (1993). «Использование масс-спектрометрической информации о молекулярной массе для идентификации белков в базах данных последовательностей». Биологическая масс-спектрометрия . 22 (6): 338–45. дои : 10.1002/bms.1200220605 . ПМИД 8329463 .
- ^ Джеймс П., Квадрони М., Карафоли Э., Гонне Дж. (1993). «Идентификация белков методом дактилоскопии массового профиля». Биохим. Биофиз. Рез. Коммун . 195 (1): 58–64. дои : 10.1006/bbrc.1993.2009 . ПМИД 8363627 .
- ^ Йейтс-младший, Спейчер С., Гриффин П.Р., Ханкапиллер Т. (1993). «Карты пептидных масс: высокоинформативный подход к идентификации белков». Анальный. Биохим . 214 (2): 397–408. дои : 10.1006/abio.1993.1514 . ПМИД 8109726 .
- ^ Перейти обратно: а б с Шевченко А, Йенсен О.Н., Подтелейников А.В., Сальокко Ф., Вильм М., Ворм О., Мортенсен П., Шевченко А., Бушери Х., Манн М. (1996). «Связывание генома и протеома с помощью масс-спектрометрии: крупномасштабная идентификация дрожжевых белков из двумерных гелей» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 93 (25): 14440–5. Бибкод : 1996PNAS...9314440S . дои : 10.1073/pnas.93.25.14440 . ПМЦ 26151 . ПМИД 8962070 .
- ^ Ван В., Сунь Дж., Нимц М., Деквер В.Д., Цзэн А.П. (2003). «Идентификация белка на основе анализа двумерного гель-электрофореза Klebsiella pneumoniae путем комбинированного использования данных масс-спектрометрии и необработанных последовательностей генома» . Протеомная наука . 1 (1): 6. дои : 10.1186/1477-5956-1-6 . ПМК 317362 . ПМИД 14653859 .
- ^ Хензель, Уильям Дж.; Ватанабэ, Колин; Стултс, Джон Т. (1 сентября 2003 г.). «Идентификация белков: истоки массового снятия отпечатков пальцев пептидов». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 14 (9): 931–942. дои : 10.1016/S1044-0305(03)00214-9 . ISSN 1044-0305 . ПМИД 12954162 .
- ^ Мацудайра, П. (25 июля 1987 г.). «Последовательность пикомольных количеств белков, нанесенных электроблоттингом на мембраны из поливинилидендифторида» . Журнал биологической химии . 262 (21): 10035–10038. дои : 10.1016/S0021-9258(18)61070-1 . ISSN 0021-9258 . ПМИД 3611052 .
- ^ Британская Колумбия Оркатт; Д.Г. Джордж; Дайхофф и М.О. (1983). «Системы баз данных последовательностей белков и нуклеиновых кислот». Ежегодный обзор биофизики и биоинженерии . 12 (1): 419–441. дои : 10.1146/annurev.bb.12.060183.002223 . ПМИД 6347043 .
- ^ Мур, RE; Ликлайдер, Л.; Шуман, Д.; Ли, Т.Д. (1 декабря 1998 г.). «Микромасштабный интерфейс электрораспыления, включающий монолитную подложку из поли(стирол-дивинилбензола) для жидкостной хроматографии / тандемного масс-спектрометрического анализа пептидов и белков в режиме онлайн». Аналитическая химия . 70 (23): 4879–4884. дои : 10.1021/ac980723p . ISSN 0003-2700 . ПМИД 9852776 .
- ^ Перейти обратно: а б Уитмор, Колин Д.; Дженнаро, Линн А. (1 июня 2012 г.). «Методы капиллярного электрофореза-масс-спектрометрии для картирования триптических пептидов терапевтических антител». Электрофорез . 33 (11): 1550–1556. дои : 10.1002/elps.201200066 . ISSN 1522-2683 . ПМИД 22736356 . S2CID 28717319 .
- ^ Тиде, Бернд (2005). «Пептидная массовая дактилоскопия». Методы . 35 (3): 237–247. дои : 10.1016/j.ymeth.2004.08.015 . ПМИД 15722220 .
- ^ Дасс, Чхабил (2007). Основы современной масс-спектрометрии | Интернет-книги Уайли . дои : 10.1002/0470118490 . ISBN 9780470118498 .