Нисходящая протеомика

Протеомика сверху вниз - это метод идентификации белков , в котором либо используется с улавливанием ионов масс-спектрометр для хранения изолированного иона белка для измерения массы, либо тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). анализа ^[1]^[2] или другие методы очистки белков, такие как двумерный гель-электрофорез в сочетании с МС/МС. ^[3] сверху вниз Протеомика способна идентифицировать и количественно оценивать уникальные протеоформы посредством анализа интактных белков. ^[4] Название происходит от аналогичного подхода к секвенированию ДНК. ^[5] Во время масс-спектрометрии неповрежденные белки обычно ионизируются электрораспылением и улавливаются в ионно-циклотронном резонансе с преобразованием Фурье ( ловушка Пеннинга ). ^[6] квадрупольная ионная ловушка (ловушка Пола) или масс-спектрометр Orbitrap . Фрагментация для тандемной масс-спектрометрии осуществляется путем диссоциации с электронозахватом или диссоциации с переносом электрона . Эффективное фракционирование имеет решающее значение для обработки проб перед протеомикой на основе масс-спектрометрии. Анализ протеома обычно включает переваривание интактных белков с последующей идентификацией предполагаемого белка с помощью масс-спектрометрии (МС). ^[7] Протеомика МС сверху вниз (без геля) исследует структуру белка путем измерения неповрежденной массы с последующей прямой диссоциацией ионов в газовой фазе. ^[8]

Преимущества

Основные преимущества нисходящего подхода включают возможность обнаружения продуктов деградации, изоформ белка , вариантов последовательностей, комбинаций посттрансляционных модификаций, а также упрощенные процессы нормализации и количественного анализа данных .
Протеомика «сверху вниз» в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле может помочь дополнить протеомный подход «снизу вверх». Протеомные методы «сверху вниз» могут помочь выявить большие отклонения от прогнозов, и они очень успешно применяются путем сочетания гель-элюирования, фракционирования на основе жидкости, захвата, электрофореза, фракционирования, осаждения белков и обращенно-фазовой ВЭЖХ с ионизацией электрораспылением и МС/МС. ^[9]
Характеристика небольших белков представляет собой серьезную проблему для восходящей протеомики из-за невозможности генерировать достаточное количество триптических пептидов для анализа. Протеомика сверху вниз позволяет обнаруживать белки малой массы, тем самым увеличивая репертуар известных белков. ^[10] В то время как протеомика «снизу вверх» интегрирует расщепленные продукты всех протеоформ, продуцируемых геном, в единую пептидную карту полноразмерного генного продукта для табулирования и количественной оценки экспрессируемых белков, основное преимущество протеомики «сверху вниз» заключается в том, что она позволяет исследователям количественно отслеживать одну или несколько протеоформ из нескольких образцов и удалить эти протеоформы для химического анализа. ^[9]

Недостатки

В недавнем прошлом подход «сверху вниз» был отнесен к анализу отдельных белков или простых смесей, тогда как сложные смеси и белки анализировались более устоявшимися методами, такими как протеомика «снизу вверх». Кроме того, идентификация белков и характеристика протеоформ в подходе TDP (протеомика сверху вниз) могут страдать от проблем с динамическим диапазоном, когда одни и те же очень распространенные виды неоднократно фрагментируются. ^[4]
Хотя протеомика сверху вниз может работать с относительно высокой производительностью для успешного картирования покрытия протеомов на большом уровне, скорость идентификации новых белков после начальных раундов довольно резко снижается. ^[4]
Протеомные исследования сверху вниз могут решить проблемы идентификации отдельных белков, но не были достигнуты в больших масштабах из-за отсутствия методов фракционирования интактных белков, интегрированных с тандемной масс-спектрометрией. ^[7]

Исследования и использование

Исследование первое: Количественное определение и идентификация тысяч человеческих протеоформ с массой ниже 30 кДа

Исследователи провели исследование человеческих протеоформ с массой ниже 30 кДа, используя первичные человеческие фибробласты IMR90, содержащие функциональную конструкцию Ras, которые выращивали в среде.
Решил использовать протеомику сверху вниз для характеристики этих протеоформ, потому что в настоящее время это лучший метод для интактных белков, поскольку, как я уже говорил, метод «снизу вверх» переваривает белок и не дает четкого изображения отдельных интактных протеоформ.
Top Down Proteomics способна идентифицировать и количественно оценивать уникальные протеоформы посредством анализа интактных белков. Количественный анализ сверху вниз выявил изменения в численности 1038 цитоплазматических протеоформ. ^[4]

Исследование второе: Сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрофокусирующего гель-электрофореза для виртуальной 2D-протеомики на основе геля.

Исследователи использовали протеомику «сверху вниз», поскольку могли идентифицировать точные протеоформы интактных белков, а не подход «снизу вверх», который дает фрагментированные ионы пептидов.
В этом исследовании использовался виртуальный 2D-гель вместе с масс-спектрометрией для разделения белковых смесей. MALDI — это компьютерное программное обеспечение, которое генерирует неповрежденные массы белков в каждой изоэлектрической точке. Все началось с изображения выбранного геля IPG-IEF (изоэлектрофокусирование), которое затем было проанализировано с помощью MALDI. ^[9]
Протеомика сверху вниз MALDI-TOF/TOF-MS более устойчива к примесям; не требует экстракции, очистки и разделения биомаркеров; и может быть применен непосредственно к интактным микроорганизмам. ^[11]

См. также

Ссылки

^ Сзе СК, Ге Й, О Х, Маклафферти Ф.В. (2002). «Масс-спектрометрия сверху вниз белка массой 29 кДа для характеристики любой посттрансляционной модификации с точностью до одного остатка» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 99 (4): 1774–9. Бибкод : 2002PNAS...99.1774S . дои : 10.1073/pnas.251691898 . ПМЦ 122269 . ПМИД 11842225 .
^ Келлехер Н.Л. (2004). «Нисходящая протеомика». Анальный. Хим . 76 (11): 197А–203А. дои : 10.1021/ac0415657 . ПМИД 15190879 .
^ Райт Е.П., Партридж М.А., Падула М.П., Гаучи В.Дж., Маллади К.С., Курсен Дж.Р. (2014). «Протеомика сверху вниз: улучшение 2D-гель-электрофореза от обработки тканей до высокочувствительного обнаружения белков» . Протеомика . 14 (7–8): 872–889. дои : 10.1002/pmic.201300424 . ПМИД 24452924 . S2CID 29866065 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с ^д Дурбин, Кеннет Роберт; Форнелли, Лука; Феллерс, Райан Т.; Даблдей, Питер Ф.; Нарита, Масаси; Келлехер, Нил Л. (2016). «Количественный анализ и идентификация тысяч человеческих протеоформ массой ниже 30 кДа» . Журнал исследований протеома . 15 (3): 976–982. doi : 10.1021/acs.jproteome.5b00997 . ПМЦ 4794255 . ПМИД 26795204 .
^ Смит CL, Кантор CR (1989). «Развивающиеся стратегии создания физических карт хромосом млекопитающих». Геном . 31 (2): 1055–8. дои : 10.1139/g89-181 . ПМИД 2698822 .
^ Богданов Б., Смит Р.Д. (2005). «Протеомика с помощью масс-спектрометрии FTICR: сверху вниз и снизу вверх» . Обзоры масс-спектрометрии . 24 (2): 168–200. Бибкод : 2005MSRv...24..168B . дои : 10.1002/мас.20015 . ПМИД 15389855 .
^ Jump up to: ^а ^б Тран, Джон К.; Замдборг, Леонид; Альф, Дороти Р.; Ли, Джи Ын; Катерман, Адам Д.; Дурбин, Кеннет Р.; Типтон, Джеремия Д.; Веллаичами, Адайккалам; Келли, Джон Ф. (8 декабря 2011 г.). «Картирование изоформ интактного белка в режиме открытия с использованием протеомики сверху вниз» . Природа . 480 (7376): 254–258. Бибкод : 2011Natur.480..254T . дои : 10.1038/nature10575 . ISSN 0028-0836 . ПМЦ 3237778 . ПМИД 22037311 .
^ Паркс, Брайан А.; Цзян, Лихуа; Томас, Пол М.; Венгер, Крейг Д.; Рот, Майкл Дж.; Бойн, Майкл Т.; Берк, Патрисия В.; Кваст, Курт Э.; Келлехер, Нил Л. (2007). «Нисходящая протеомика в хроматографической шкале времени с использованием гибридных масс-спектрометров с преобразованием Фурье с линейной ионной ловушкой» . Аналитическая химия . 79 (21): 7984–7991. дои : 10.1021/ac070553t . ПМК 2361135 . ПМИД 17915963 .
^ Jump up to: ^а ^б ^с Лонес, Карен; Квеббеманн, Нил Р.; Лю, Кейт; Кобзефф, Фред; Лоо, Джозеф А.; Огорзалек Лоо, Рэйчел Р. (2016). «Сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрофокусирующего гель-электрофореза для виртуальной 2D-протеомики на основе геля» . Методы . 104 : 163–169. дои : 10.1016/j.ymeth.2016.01.013 . ПМЦ 4930893 . ПМИД 26826592 .
^ Лоренцатто, Карина Р.; Ким, Кёнгон; Нтай, Иоанна; Палудо, Габриэла П.; Камарго де Лима, Джеферсон; Томас, Пол М.; Келлехер, Нил Л.; Феррейра, Энрике Б. (06 ноября 2015 г.). «Протеомика сверху вниз выявляет зрелые протеоформы, экспрессируемые в субклеточных фракциях предвзрослой стадии Echinococcus granulosus» . Журнал исследований протеома . 14 (11): 4805–4814. doi : 10.1021/acs.jproteome.5b00642 . ISSN 1535-3907 . ПМЦ 4638118 . ПМИД 26465659 .
^ Демирев Пламен А.; Фельдман, Эндрю Б.; Ковальски, Пол; Лин, Джеффри С. (2005). «Нисходящая протеомика для быстрой идентификации интактных микроорганизмов». Аналитическая химия . 77 (22): 7455–7461. дои : 10.1021/ac051419g . PMID 16285700 .

Библиография

Борчерс Ч., Тапар Р., Петротченко Е.В. и др. (2006). «Комбинированная протеомика сверху вниз и снизу вверх идентифицирует сайт фосфорилирования в белках, связывающих стебель-петлю, который способствует высокоаффинному связыванию РНК» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 103 (9): 3094–9. Бибкод : 2006PNAS..103.3094B . дои : 10.1073/pnas.0511289103 . ПМЦ 1413926 . ПМИД 16492733 .
Хан X, Джин М., Брейкер К., Маклафферти Ф.В. (2006). «Распространение масс-спектрометрии сверху вниз на белки с массой более 200 килодальтон». Наука . 314 (5796): 109–12. Бибкод : 2006Sci...314..109H . дои : 10.1126/science.1128868 . ПМИД 17023655 . S2CID 39929757 .
Уайтлегг Дж., Халганд Ф., Суда П., Забрусков В. (2006). «Нисходящая масс-спектрометрия интегральных мембранных белков». Экспертное обозрение по протеомике . 3 (6): 585–96. дои : 10.1586/14789450.3.6.585 . ПМИД 17181473 . S2CID 21563381 .

[pmid11842225-1] Сзе СК, Ге Й, О Х, Маклафферти Ф.В. (2002). «Масс-спектрометрия сверху вниз белка массой 29 кДа для характеристики любой посттрансляционной модификации с точностью до одного остатка» . Учеб. Натл. акад. наук. США . 99 (4): 1774–9. Бибкод : 2002PNAS...99.1774S . дои : 10.1073/pnas.251691898 . ПМЦ 122269 . ПМИД 11842225 .

[pmid15190879-2] Келлехер Н.Л. (2004). «Нисходящая протеомика». Анальный. Хим . 76 (11): 197А–203А. дои : 10.1021/ac0415657 . ПМИД 15190879 .

[3] Райт Е.П., Партридж М.А., Падула М.П., Гаучи В.Дж., Маллади К.С., Курсен Дж.Р. (2014). «Протеомика сверху вниз: улучшение 2D-гель-электрофореза от обработки тканей до высокочувствительного обнаружения белков» . Протеомика . 14 (7–8): 872–889. дои : 10.1002/pmic.201300424 . ПМИД 24452924 . S2CID 29866065 .

[:1-4] Jump up to: ^а ^б ^с ^д Дурбин, Кеннет Роберт; Форнелли, Лука; Феллерс, Райан Т.; Даблдей, Питер Ф.; Нарита, Масаси; Келлехер, Нил Л. (2016). «Количественный анализ и идентификация тысяч человеческих протеоформ массой ниже 30 кДа» . Журнал исследований протеома . 15 (3): 976–982. doi : 10.1021/acs.jproteome.5b00997 . ПМЦ 4794255 . ПМИД 26795204 .

[pmid2698822-5] Смит CL, Кантор CR (1989). «Развивающиеся стратегии создания физических карт хромосом млекопитающих». Геном . 31 (2): 1055–8. дои : 10.1139/g89-181 . ПМИД 2698822 .

[pmid15389855-6] Богданов Б., Смит Р.Д. (2005). «Протеомика с помощью масс-спектрометрии FTICR: сверху вниз и снизу вверх» . Обзоры масс-спектрометрии . 24 (2): 168–200. Бибкод : 2005MSRv...24..168B . дои : 10.1002/мас.20015 . ПМИД 15389855 .

[:0-7] Jump up to: ^а ^б Тран, Джон К.; Замдборг, Леонид; Альф, Дороти Р.; Ли, Джи Ын; Катерман, Адам Д.; Дурбин, Кеннет Р.; Типтон, Джеремия Д.; Веллаичами, Адайккалам; Келли, Джон Ф. (8 декабря 2011 г.). «Картирование изоформ интактного белка в режиме открытия с использованием протеомики сверху вниз» . Природа . 480 (7376): 254–258. Бибкод : 2011Natur.480..254T . дои : 10.1038/nature10575 . ISSN 0028-0836 . ПМЦ 3237778 . ПМИД 22037311 .

[8] Паркс, Брайан А.; Цзян, Лихуа; Томас, Пол М.; Венгер, Крейг Д.; Рот, Майкл Дж.; Бойн, Майкл Т.; Берк, Патрисия В.; Кваст, Курт Э.; Келлехер, Нил Л. (2007). «Нисходящая протеомика в хроматографической шкале времени с использованием гибридных масс-спектрометров с преобразованием Фурье с линейной ионной ловушкой» . Аналитическая химия . 79 (21): 7984–7991. дои : 10.1021/ac070553t . ПМК 2361135 . ПМИД 17915963 .

[:2-9] Jump up to: ^а ^б ^с Лонес, Карен; Квеббеманн, Нил Р.; Лю, Кейт; Кобзефф, Фред; Лоо, Джозеф А.; Огорзалек Лоо, Рэйчел Р. (2016). «Сочетание высокопроизводительной масс-спектрометрии MALDI-TOF и изоэлектрофокусирующего гель-электрофореза для виртуальной 2D-протеомики на основе геля» . Методы . 104 : 163–169. дои : 10.1016/j.ymeth.2016.01.013 . ПМЦ 4930893 . ПМИД 26826592 .

[10] Лоренцатто, Карина Р.; Ким, Кёнгон; Нтай, Иоанна; Палудо, Габриэла П.; Камарго де Лима, Джеферсон; Томас, Пол М.; Келлехер, Нил Л.; Феррейра, Энрике Б. (06 ноября 2015 г.). «Протеомика сверху вниз выявляет зрелые протеоформы, экспрессируемые в субклеточных фракциях предвзрослой стадии Echinococcus granulosus» . Журнал исследований протеома . 14 (11): 4805–4814. doi : 10.1021/acs.jproteome.5b00642 . ISSN 1535-3907 . ПМЦ 4638118 . ПМИД 26465659 .

[11] Демирев Пламен А.; Фельдман, Эндрю Б.; Ковальски, Пол; Лин, Джеффри С. (2005). «Нисходящая протеомика для быстрой идентификации интактных микроорганизмов». Аналитическая химия . 77 (22): 7455–7461. дои : 10.1021/ac051419g . PMID 16285700 .

[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]