Протеомика дробовика
Протеомика «дробовика» относится к использованию методов протеомики «снизу вверх» для идентификации белков в сложных смесях с использованием комбинации высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией . [1] [2] [3] [4] [5] [6] Название происходит от секвенирования ДНК дробовика , которое само по себе названо в честь быстро расширяющейся, квазислучайной схемы стрельбы из дробовика . Самый распространенный метод протеомики белков в смеси дробовика начинается с расщепления , а полученные пептиды разделяются с помощью жидкостной хроматографии. тандемную масс-спектрометрию Затем для идентификации пептидов используют .
Целевая протеомика с использованием SRM и методов сбора данных, не зависящих от данных, часто считается альтернативой дробовой протеомике в области восходящей протеомики . В то время как дробовая протеомика использует зависимый от данных отбор ионов-предшественников для создания сканирований фрагментных ионов, вышеупомянутые методы используют детерминированный метод для получения сканирований фрагментарных ионов.
История
[ редактировать ]Протеомика дробовика возникла из-за трудностей использования предыдущих технологий для разделения сложных смесей. В 1975 году О'Фаррелл и Клозе описали двумерный электрофорез в полиакриламидном геле ( 2D-PAGE ), позволяющий разделять сложные смеси белков. [7] [8] Развитие матричной лазерной десорбционной ионизации ( MALDI ), ионизации электрораспылением ( ESI ) и поиска в базах данных продолжало расширять область протеомики. Однако эти методы по-прежнему сталкивались с трудностями при идентификации и разделении белков с низким содержанием, аберрантных белков и мембранных белков. Протеомика дробовика появилась как метод, позволяющий расщеплять даже эти белки. [5]
Преимущества
[ редактировать ]Протеомика дробовика позволяет идентифицировать глобальные белки, а также дает возможность систематически профилировать динамические протеомы. [9] Это также позволяет избежать скромной эффективности разделения и плохой масс-спектральной чувствительности, свойственной анализу интактного белка. [1]
Недостатки
[ редактировать ]Фильтрация динамического исключения, которая часто используется в протеомике дробовика, максимизирует количество идентифицированных белков за счет случайной выборки. [10] Эта проблема может усугубляться недостаточной выборкой, присущей дробовой протеомике. [11]
Рабочий процесс
[ редактировать ]Выращивают клетки, содержащие желаемый белковый комплемент. Затем белки экстрагируют из смеси и расщепляют протеазой с получением смеси пептидов. [9] Затем смесь пептидов загружают непосредственно в микрокапиллярную колонку и пептиды разделяют по гидрофобности и заряду. пептидов По мере элюирования из колонки они ионизируются и разделяются по m/z на первой стадии тандемной масс-спектрометрии . Выбранные ионы подвергаются диссоциации, вызванной столкновением , или другому процессу, вызывающему фрагментацию. Заряженные фрагменты разделяются на втором этапе тандемной масс-спектрометрии.
«Отпечаток пальца» масс-спектра фрагментации каждого пептида используется для идентификации белка, из которого они происходят, путем поиска в базе данных последовательностей с помощью коммерчески доступного программного обеспечения (например, Sequest или Mascot ). [9] Примерами баз данных последовательностей являются база данных Genpept или база данных PIR. [12] После поиска в базе данных каждое совпадение пептидного спектра (PSM) необходимо оценить на достоверность. [13] Этот анализ позволяет исследователям составить профиль различных биологических систем. [9]
Проблемы с идентификацией пептидов
[ редактировать ]Вырожденные пептиды (совместно используемые двумя или более белками в базе данных) затрудняют однозначную идентификацию белка, которому они принадлежат. Кроме того, некоторые образцы протеома позвоночных животных имеют большое количество паралогов , а альтернативный сплайсинг у высших эукариот может привести к образованию множества идентичных белковых подпоследовательностей. [1] Более того, многие белки модифицируются естественным путем (ко- или посттрансляционно) или искусственно (артефакты подготовки проб). Это еще больше усложняет идентификацию пептидной последовательности с помощью традиционных подходов к сопоставлению баз данных. Вместе со спектрами фрагментации пептидов низкого качества или высокой сложности (из-за ограничений совместной изоляции или чувствительности) это оставляет в обычном эксперименте по протеомике дробовика многие спектры секвенирования неидентифицированными. [14] [15] [16] [17]
Практическое применение
[ редактировать ]После секвенирования человеческого генома следующим шагом станет проверка и функциональная аннотация всех предсказанных генов и их белковых продуктов. [4] Протеомика дробовика может использоваться для функциональной классификации или сравнительного анализа этих белковых продуктов. Его можно использовать в различных проектах: от крупномасштабного целого протеома до сосредоточения внимания на одном семействе белков. Это можно сделать в исследовательских лабораториях или на коммерческой основе.
Масштабный анализ
[ редактировать ]Одним из примеров этого является исследование Уошберна, Уолтерса и Йейтса, в котором они использовали дробовую протеомику на протеоме штамма Saccharomyces cerevisiae , выращенного до средней логарифмической фазы. Им удалось обнаружить и идентифицировать 1484 белка, а также идентифицировать белки, редко встречающиеся при анализе протеома, включая белки с низким содержанием, такие как факторы транскрипции и протеинкиназы . Им также удалось идентифицировать 131 белок с тремя или более предсказанными трансмембранными доменами . [2]
Белковая семья
[ редактировать ]Вайсар и др. использует протеомику дробовика, чтобы выявить ингибирование протеаз и активацию комплемента в противовоспалительных свойствах липопротеинов высокой плотности . [18] В исследовании Lee et al. более высокий уровень экспрессии hnRNP A2/B1 и Hsp90 наблюдался в клетках гепатомы человека HepG2 , чем в клетках дикого типа. Это привело к поиску известных функциональных ролей, согласованно опосредованных обоими этими многофункциональными клеточными шаперонами. [19]
См. также
[ редактировать ]- Протеомика снизу вверх
- Программное обеспечение для масс-спектрометрии
- Белковая масс-спектрометрия
- Липидомика дробовика
- Нисходящая протеомика
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Алвес П., Арнольд Р.Дж., Новотный М.В., Радивояк П., Рейли Дж.П., Тан Х (2007). «Прогресс в выводе белков на основе дробовой протеомики с использованием обнаруживаемости пептидов». Тихоокеанский симпозиум по биокомпьютингу. Тихоокеанский симпозиум по биокомпьютингу : 409–20. ПМИД 17990506 .
- ^ Jump up to: а б Член парламента Уошберна, Уолтерс Д., Йейтс-младший (март 2001 г.). «Крупномасштабный анализ протеома дрожжей с помощью технологии многомерной идентификации белков». Природная биотехнология . 19 (3): 242–7. дои : 10.1038/85686 . ПМИД 11231557 . S2CID 16796135 .
- ^ Уолтерс Д.А., член парламента Уошберна, Йейтс-младший (декабрь 2001 г.). «Автоматизированная технология многомерной идентификации белков для дробовой протеомики». Аналитическая химия . 73 (23): 5683–90. дои : 10.1021/ac010617e . ПМИД 11774908 .
- ^ Jump up to: а б Ху Л, Е М, Цзян Х, Фэн С, Цзоу Х (август 2007 г.). «Достижения в области аналитических методов дробового анализа протеомов и пептидомов - обзор». Аналитика Химика Акта . 598 (2): 193–204. дои : 10.1016/j.aca.2007.07.046 . ПМИД 17719892 .
- ^ Jump up to: а б Фурнье М.Л., Гилмор Дж.М., Мартин-Браун С.А., член парламента Уошберна (август 2007 г.). «Протеомика дробовика на основе многомерного разделения». Химические обзоры . 107 (8): 3654–86. дои : 10.1021/cr068279a . ПМИД 17649983 .
- ^ Несвижский А.И. (2007). «Идентификация белков с помощью тандемной масс-спектрометрии и поиска в базе данных последовательностей». Анализ данных масс-спектрометрии в протеомике . Методы Мол. Биол. Том. 367. стр. 87–119. дои : 10.1385/1-59745-275-0:87 . ISBN 978-1-59745-275-5 . ПМИД 17185772 .
- ^ О'Фаррелл П.Х. (май 1975 г.). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения» . Журнал биологической химии . 250 (10): 4007–21. дои : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . ПМЦ 2874754 . ПМИД 236308 .
- ^ Клозе Дж (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точковых мутаций у млекопитающих». Гумангенетика . 26 (3): 231–43. дои : 10.1007/bf00281458 . ПМИД 1093965 . S2CID 30981877 .
- ^ Jump up to: а б с д Ву CC, MacCoss MJ (июнь 2002 г.). «Дробовая протеомика: инструменты анализа сложных биологических систем». Современное мнение о молекулярной терапии . 4 (3): 242–50. ПМИД 12139310 .
- ^ Чжан Б., ВерБеркмос, Северная Каролина, Лэнгстон М.А., Убербахер Э., Хеттич Р.Л., Саматова Н.Ф. (ноябрь 2006 г.). «Обнаружение дифференциальной и коррелированной экспрессии белков в протеомике без меток». Журнал исследований протеома . 5 (11): 2909–18. дои : 10.1021/pr0600273 . ПМИД 17081042 . S2CID 22254554 .
- ^ Толмачев А.В., Монро М.Е., Первин С.О., Мур Р.Дж., Джейтли Н., Адкинс Дж.Н. и др. (ноябрь 2008 г.). «Характеристика стратегий получения достоверной идентификации при восходящих протеомных измерениях с использованием гибридных инструментов FTMS» . Аналитическая химия . 80 (22): 8514–25. дои : 10.1021/ac801376g . ПМЦ 2692492 . ПМИД 18855412 .
- ^ Энг Дж.К., МакКормак А.Л., Йейтс-младший (ноябрь 1994 г.). «Подход к корреляции тандемных масс-спектральных данных пептидов с аминокислотными последовательностями в базе данных белков» . Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 5 (11): 976–89. CiteSeerX 10.1.1.377.3188 . дои : 10.1016/1044-0305(94)80016-2 . ПМИД 24226387 . S2CID 18413192 .
- ^ Серкейра Ф.Р., Феррейра Р.С., Оливейра А.П., Гомес А.П., Рамос Х.Дж., Грабер А., Баумгартнер К. (1 января 2012 г.). «МУМАЛ: многомерный анализ в протеомике дробовика с использованием методов машинного обучения» . БМК Геномика . 13 (Приложение 5): S4. дои : 10.1186/1471-2164-13-S5-S4 . ПМК 3477001 . ПМИД 23095859 .
- ^ Грисс Дж., Перес-Риверол Ю., Льюис С., Табб Д.Л., Дайанс Дж.А., Дель-Торо Н. и др. (август 2016 г.). «Распознавание миллионов постоянно неопознанных спектров в сотнях наборов данных протеомики дробовика» . Природные методы . 13 (8): 651–656. дои : 10.1038/nmeth.3902 . ПМЦ 4968634 . ПМИД 27493588 .
- ^ ден Риддер М., Даран-Лапухаде П., Пабст М. (февраль 2020 г.). «Протеомика дробовика: почему важны тысячи неопознанных сигналов» . Исследование дрожжей FEMS . 20 (1). дои : 10.1093/femsyr/foz088 . ПМИД 31860055 .
- ^ Михальски А., Кокс Дж., Манн М. (апрель 2011 г.). «Более 100 000 обнаруживаемых видов пептидов элюируются в ходе одиночных протеомных исследований, но большинство из них недоступны для зависимой от данных ЖХ-МС/МС». Журнал исследований протеома . 10 (4): 1785–93. дои : 10.1021/pr101060v . ПМИД 21309581 .
- ^ Девабхактуни А., Лин С., Чжан Л., Сваминатан К., Гонсалес К.Г., Олссон Н. и др. (апрель 2019 г.). «TagGraph раскрывает обширные ландшафты модификаций белков на основе больших наборов данных тандемной масс-спектрометрии» . Природная биотехнология . 37 (4): 469–479. дои : 10.1038/s41587-019-0067-5 . ПМК 6447449 . ПМИД 30936560 .
- ^ Вайсар Т., Пеннатур С., Грин П.С., Гариб С.А., Хофнагл А.Н., Чунг М.К. и др. (март 2007 г.). «Протеомика дробовика предполагает ингибирование протеаз и активацию комплемента в противовоспалительных свойствах ЛПВП» . Журнал клинических исследований . 117 (3): 746–56. дои : 10.1172/JCI26206 . ПМК 1804352 . ПМИД 17332893 .
- ^ Ли К.Л., Сяо Х.Х., Линь К.В., Ву С.П., Хуан С.И., Ву С.И. и др. (декабрь 2003 г.). «Подход стратегической протеомики для эффективного построения карты экспрессии целевых семейств белков в клеточных линиях гепатомы» . Протеомика . 3 (12): 2472–86. дои : 10.1002/pmic.200300586 . ПМИД 14673797 . S2CID 24518852 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Маркотт Э.М. (июль 2007 г.). «Как алгоритмы протеомики дробовика идентифицируют белки?». Природная биотехнология . 25 (7): 755–7. дои : 10.1038/nbt0707-755 . ПМИД 17621303 . S2CID 14256080 .
- Винстра, Тимоти Д.; Йейтс, Джон Р. (2006). Протеомика для биологических открытий . Нью-Йорк: Вили-Лисс. ISBN 978-0-471-16005-2 .
- Йейтс-младший, Русе С.И., Накорчевский А. (2009). «Протеомика методом масс-спектрометрии: подходы, достижения и приложения». Ежегодный обзор биомедицинской инженерии . 11 : 49–79. doi : 10.1146/annurev-bioeng-061008-124934 . ПМИД 19400705 .
- Ляо Л., МакКлатчи Д.Б., Йейтс-младший (июль 2009 г.). «Протеомика дробовика в нейробиологии» . Нейрон . 63 (1): 12–26. дои : 10.1016/j.neuron.2009.06.011 . ПМК 2746002 . ПМИД 19607789 .