Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток
Мечение стабильными изотопами аминокислотами в культуре клеток ( SILAC ) — это метод, основанный на масс-спектрометрии нерадиоактивными , который выявляет различия в содержании белка в образцах с использованием мечения изотопами . [1] [2] [3] [4] Это популярный метод количественной протеомики .
Процедура
[ редактировать ]культивируют две популяции клеток В культуре клеток . Одну из клеточных популяций питают питательной средой, содержащей нормальные аминокислоты . Напротив, вторую популяцию кормят питательной средой, содержащей аминокислоты, меченные стабильными (нерадиоактивными) тяжелыми изотопами . Например, среда может содержать аргинин , меченный шестью атомами углерода-13 ( 13 В) вместо обычного углерода-12 ( 12 С). Когда клетки растут в этой среде, они включают тяжелый аргинин во все свои белки. После этого все пептиды, содержащие один аргинин, становятся на 6 Да тяжелее своих обычных аналогов. Альтернативно, единая маркировка с 13 С или 15 Н можно использовать. Белки из обеих клеточных популяций объединяют и анализируют вместе с помощью масс-спектрометрии , поскольку пары химически идентичных пептидов с различным составом стабильных изотопов можно дифференцировать в масс-спектрометре благодаря разнице их масс. Соотношение интенсивностей пиков в масс-спектре таких пар пептидов отражает соотношение содержаний двух белков. [5] [3]
Приложения
[ редактировать ]Подход SILAC, включающий включение тирозина , меченного девятью атомами углерода-13 ( 13 В) вместо обычного углерода-12 ( 12 C) использовался для изучения субстратов тирозинкиназы в сигнальных путях. [6] SILAC стал очень мощным методом изучения клеточной сигнализации , посттрансляционных модификаций, таких как фосфорилирование , [6] [7] белок-белковое взаимодействие и регуляция экспрессии генов . Кроме того, SILAC стал важным методом секретомики — глобального исследования секретируемых белков и секреторных путей. [8] Его можно использовать для различения белков, секретируемых клетками в культуре, и примесей сыворотки. [9] Также были опубликованы стандартизированные протоколы SILAC для различных приложений. [10] [11]
Импульсный СИЛАК
[ редактировать ]Импульсный SILAC (pSILAC) представляет собой вариант метода SILAC, при котором меченые аминокислоты добавляются в питательную среду только на короткий период времени. Это позволяет отслеживать различия в производстве белка de novo, а не в сырой концентрации. [12]
НейКод СИЛАК
[ редактировать ]Традиционно уровень мультиплексирования в SILAC был ограничен из-за количества доступных изотопов SILAC. Недавно новый метод под названием NeuCode (нейтронное кодирование) SILAC увеличил уровень мультиплексирования, достижимый при метаболическом мечении (до 4). [13] Аминокислотный метод NeuCode аналогичен методу SILAC, но отличается тем, что при маркировке используются только тяжелые аминокислоты. Использование только тяжелых аминокислот устраняет необходимость 100% включения аминокислот, необходимых для SILAC. Повышенная способность мультиплексирования аминокислот NeuCode обусловлена использованием дефектов массы из-за дополнительных нейтронов в стабильных изотопах. Однако эти небольшие различия в массах необходимо устранять с помощью масс-спектрометров высокого разрешения.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Ода Ю, Хуан К., Кросс ФР, Коуберн Д., Чайт Б.Т. (июнь 1999 г.). «Точная количественная оценка экспрессии белка и сайт-специфического фосфорилирования» . Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки . 96 (12): 6591–6596. Бибкод : 1999PNAS...96.6591O . дои : 10.1073/pnas.96.12.6591 . ЧВК 21959 . ПМИД 10359756 .
- ^ Цзян Х, English AM (2002). «Количественный анализ протеома дрожжей путем включения изотопно-меченного лейцина». Журнал исследований протеома . 1 (4): 345–350. дои : 10.1021/pr025523f . ПМИД 12645890 .
- ^ Jump up to: а б Онг С.Е., Благоев Б., Крачмарова И., Кристенсен Д.Б., Стин Х., Панди А., Манн М. (май 2002 г.). «Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток, SILAC, как простой и точный подход к протеомике экспрессии» . Молекулярная и клеточная протеомика . 1 (5): 376–386. дои : 10.1074/mcp.M200025-MCP200 . ПМИД 12118079 .
- ^ Чжу Х, Пан С, Гу С, Брэдбери Э.М., Чен X (2002). «Метка стабильных изотопов аминокислотных остатков для количественной протеомики» . Быстрая связь в масс-спектрометрии . 16 (22): 2115–2123. Бибкод : 2002RCMS...16.2115Z . дои : 10.1002/rcm.831 . ПМИД 12415544 .
- ^ Шотерс Ф., Ван Дейк П. (2019). «Белко-белковые взаимодействия у Candida albicans » . Границы микробиологии . 10 :1792 дои : 10.3389/fmicb.2019.01792 . ПМК 6693483 . ПМИД 31440220 .
- ^ Jump up to: а б Ибаррола Н., Молина Х., Ивахори А., Панди А. (апрель 2004 г.). «Новый протеомный подход для специфической идентификации субстратов тирозинкиназы с использованием [13C] тирозина» . Журнал биологической химии . 279 (16): 15805–15813. дои : 10.1074/jbc.M311714200 . ПМИД 14739304 .
- ^ Ибаррола Н., Калуме Д.Е., Гронборг М., Ивахори А., Панди А. (ноябрь 2003 г.). «Протеомный подход к количественному определению фосфорилирования с использованием мечения стабильными изотопами в культуре клеток». Аналитическая химия . 75 (22): 6043–6049. дои : 10.1021/ac034931f . ПМИД 14615979 .
- ^ Хатхут Ю. (апрель 2007 г.). «Подходы к изучению клеточного секретома». Экспертное обозрение по протеомике . 4 (2): 239–248. дои : 10.1586/14789450.4.2.239 . ПМИД 17425459 . S2CID 26169223 .
- ^ Полачек М., Брюун Х.А., Йохансен О., Мартинес И. (август 2010 г.). «Различия в секретоме хрящевых эксплантов и культивируемых хондроцитов, выявленные с помощью технологии SILAC» . Журнал ортопедических исследований . 28 (8): 1040–1049. дои : 10.1002/jor.21067 . ПМИД 20108312 . S2CID 41057768 .
- ^ Аманчи Р., Калуме Д.Е., Панди А. (январь 2005 г.). «Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC) для изучения динамики содержания белков и посттрансляционных модификаций». СТКЭ науки . 2005 (267): табл.2. дои : 10.1126/stke.2672005pl2 . ПМИД 15657263 . S2CID 12089034 .
- ^ Харша Х.К., Молина Х., Панди А. (2008). «Количественная протеомика с использованием мечения стабильными изотопами аминокислот в культуре клеток». Протоколы природы . 3 (3): 505–516. дои : 10.1038/nprot.2008.2 . ПМИД 18323819 . S2CID 24190501 .
- ^ Шванхойссер Б., Госсен М., Диттмар Г., Зельбах М. (январь 2009 г.). «Глобальный анализ трансляции клеточных белков с помощью импульсного SILAC». Протеомика . 9 (1): 205–209. дои : 10.1002/pmic.200800275 . ПМИД 19053139 . S2CID 23130202 .
- ^ Меррилл А.Е., Хеберт А.С., МакГилврей М.Э., Роуз К.М., Бэйли Д.Д., Брэдли Дж.К. и др. (сентябрь 2014 г.). «Метки NeuCode для относительного количественного определения белка» . Молекулярная и клеточная протеомика . 13 (9): 2503–2512. дои : 10.1074/mcp.M114.040287 . ПМК 4159665 . ПМИД 24938287 .
Дальнейшее чтение
[ редактировать ]- Онг С.Е., Крачмарова И., Манн М. (2003). «Свойства 13C-замещенного аргинина при мечении стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC)». Журнал исследований протеома . 2 (2): 173–181. дои : 10.1021/pr0255708 . ПМИД 12716131 .
- Онг С.Е., Манн М. (2006). «Практический рецепт мечения стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток (SILAC)». Протоколы природы . 1 (6): 2650–2660. дои : 10.1038/nprot.2006.427 . ПМИД 17406521 . S2CID 10651610 .
- Онг С.Е., Манн М. (2007). «Мечение стабильных изотопов аминокислотами в культуре клеток для количественной протеомики». Количественная протеомика методом масс-спектрометрии . Методы молекулярной биологии. Том. 359. стр. 37–52. дои : 10.1007/978-1-59745-255-7_3 . ISBN 978-1-58829-571-2 . ПМИД 17484109 .