Секретомика
Секретомика — это тип протеомики , который включает анализ секретома — всех секретируемых белков клетки, ткани или организма. [1] Секретируемые белки участвуют во множестве физиологических процессов, включая передачу сигналов в клетках и ремоделирование матрикса , но также являются неотъемлемой частью инвазии и метастазирования злокачественных клеток . [2] Таким образом, секретомика сыграла особенно важную роль в открытии биомаркеров рака . [3] и понимание молекулярных основ патогенеза. [4] [5] Анализ нерастворимой фракции секретома ( внеклеточного матрикса ) получил название матрисомики. [6]
История секретома
[ редактировать ]В 2000 году Тьялсма и др. ввели термин «секретом» в своем исследовании эубактерии B. subtilis . Они определили секретом как все секретируемые белки и секреторный аппарат бактерий. Используя базу данных белковых последовательностей B. subtilis и алгоритм, который исследовал сайты расщепления и амино-концевые сигнальные пептиды, характерные для секретируемых белков, они смогли предсказать, какая часть протеома секретируется клеткой. [7] В 2001 году та же лаборатория установила стандарт секретомики: прогнозов, основанных только на аминокислотной последовательности, недостаточно для определения секретома. Они использовали двумерный гель-электрофорез и масс-спектрометрию для идентификации 82 белков, секретируемых B. subtilis , только 48 из которых были предсказаны с использованием геномного метода их предыдущей статьи. [8] Это демонстрирует необходимость белковой проверки предсказанных результатов.
Поскольку была выявлена сложная природа секреторных путей, а именно наличие множества неклассических путей секреции и множества несекретируемых белков, которые являются частью классического секреторного пути, возникла необходимость в более глубоком определении секретома. . В 2010 году Агравал и др. предложил определить секретом как «глобальную группу белков, секретируемых во внеклеточное пространство клеткой, тканью, органом или организмом в любой момент времени и при любых условиях посредством известных и неизвестных секреторных механизмов, включающих конститутивные и регулируемые секреторные органеллы». [9]
Проблемы секретомного анализа
[ редактировать ]Загрязняющие вещества
[ редактировать ]В культуре клетки окружены примесями. Бычья сыворотка из сред для культивирования клеток и клеточный мусор могут загрязнять коллекцию секретируемых белков, используемых для анализа. Загрязнения крупного рогатого скота представляют собой особую проблему, поскольку белковые последовательности многих внеклеточных белков крупного рогатого скота, таких как фибронектин и фибулин-1 , аналогичны последовательностям белков человека. [1] Чтобы удалить эти загрязнения, клетки можно промыть PBS или бессывороточной средой (SFM) перед инкубацией в SFM и сбором секретируемых белков. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не лопнуть клетки, высвободив внутриклеточные белки. [1] Кроме того, время и условия инкубации должны быть оптимизированы так, чтобы метаболический стресс, который может быть вызван недостатком питательных веществ в SFM, не влиял на секретомный анализ. [10]
Низкая концентрация
[ редактировать ]Некоторые белки секретируются в небольшом количестве, а затем дополнительно разбавляются в среде культуры клеток или жидкостях организма, что затрудняет обнаружение и анализ этих белков. Могут использоваться методы концентрирования, такие как осаждение ТСА. [10] а также высокочувствительные методы, такие как микрочипы антител , которые могут обнаружить даже отдельные молекулы белка. [11]
Актуальность in vitro исследований
[ редактировать ]Многие секретомные исследования проводятся in vitro с использованием методов культивирования клеток, но неясно, секретируются ли те же белки in vivo . Все больше и больше исследований, особенно тех, которые изучают секретому рака, используют методы in vivo для подтверждения значимости результатов, полученных in vitro . Например, проксимальные биологические жидкости можно собрать рядом с опухолью для проведения секретомного анализа. [1]
Методы
[ редактировать ]Полногеномное предсказание
[ редактировать ]Многие секретируемые белки имеют N-концевую пептидную последовательность, которая сигнализирует о перемещении транслируемого белка в эндоплазматический ретикулум , где происходит процессинг, который в конечном итоге приведет к секреции. Присутствие этих сигнальных пептидов можно использовать для прогнозирования секретома клетки. [1] Некоторые секреторные белки не имеют классических последовательностей сигнальных пептидов. Их называют «секреторными белками без лидера» (LSP).
Методы полногеномного прогнозирования имеют множество проблем. Существует высокая вероятность ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Кроме того, на экспрессию генов сильно влияют условия окружающей среды, а это означает, что секретом, предсказанный на основе генома или библиотеки кДНК , вряд ли будет полностью соответствовать истинному секретому. [9] Протеомные подходы необходимы для проверки любых предсказанных секретируемых белков.
Доступно несколько полногеномных баз данных или баз знаний секретомов, основанных как на курировании, так и на компьютерном прогнозировании. Эти базы данных включают базу данных секретомов грибов (FSD), базу данных секретомов грибов (FunSecKB), [12] и база данных секретома молочнокислых бактерий. [13] база данных субклеточного местоположения белков человека и животных ( MetaSecKB ) и база данных субклеточных протеомов протистов ( ProtSecKB Недавно также были выпущены ). Хотя в вычислительном прогнозе есть некоторые неточности, эти базы данных предоставляют полезные ресурсы для дальнейшей характеристики субклеточного расположения белков.
Протеомные подходы
[ редактировать ]Масс-спектрометрический анализ является неотъемлемой частью секретомики. Сыворотку или супернатант, содержащий секретированные белки, расщепляют протеазой , и белки разделяют методами 2D-гель-электрофореза или хроматографических методов. Затем каждый отдельный белок анализируется с помощью масс-спектрометрии, и полученный массовый отпечаток пептида может быть пропущен через базу данных для идентификации белка. [1]
Мечение стабильными изотопами аминокислот в культуре клеток (SILAC) стало важным методом секретомики: оно помогает различать секретируемые белки и примеси бычьей сыворотки в культуре клеток. Супернатант от клеток, выращенных в нормальной среде, и клеток, выращенных в среде с меченными стабильным изотопом аминокислотами, смешивают в соотношении 1:1 и анализируют масс-спектрометрией. Белковые примеси в сыворотке демонстрируют только один пик, поскольку у них нет меченого эквивалента. [1] Например, метод SILAC успешно использовался для различения белков, секретируемых хондроцитами человека в культуре, и примесей сыворотки. [14]
Микрочип антител — это высокочувствительный и высокопроизводительный метод обнаружения белков, который недавно стал частью секретомного анализа. Антитела или другой тип связующей молекулы фиксируются на твердой подложке и добавляется флуоресцентно-меченная белковая смесь. Интенсивность сигнала используется для идентификации белков. Микрочипы антител чрезвычайно универсальны – их можно использовать для анализа количества белка в смеси, различных изоформ белка , посттрансляционных модификаций и биохимической активности белков. Кроме того, эти микрочипы очень чувствительны – они могут обнаруживать отдельные молекулы белка. Микрочипы антител в настоящее время используются в основном для анализа образцов плазмы человека , но также могут использоваться для секретомики культивируемых клеток и жидкостей организма, представляя простой способ одновременного обнаружения присутствия множества белков. [11]
Последствия и значение
[ редактировать ]Открытие биомаркеров рака
[ редактировать ]Помимо того, что секретируемые белки играют важную роль в нормальных физиологических процессах, они также играют важную роль в онкогенезе посредством роста клеток, миграции, инвазии и ангиогенеза , что делает секретомику отличным методом обнаружения биомаркеров рака. [15] Использование протеомного метода жидкости организма или полной сыворотки для идентификации биомаркеров может быть чрезвычайно трудным — жидкости организма сложны и сильно варьируются. Секретомный анализ линий раковых клеток или пораженной ткани представляет собой более простую и специфичную альтернативу обнаружению биомаркеров. [10]
Двумя основными биологическими источниками секретомики рака являются супернатанты линий раковых клеток и проксимальные биологические жидкости, жидкости, контактирующие с опухолью . Супернатант линии раковых клеток является привлекательным источником секретируемых белков. Существует множество стандартизированных клеточных линий, и надосадочную жидкость гораздо проще анализировать, чем проксимальную жидкость организма. Но неясно, является ли секретом клеточной линии хорошим представлением реальной опухоли в ее специфическом микроокружении, а стандартизированная клеточная линия не является иллюстрацией гетерогенности реальной опухоли. [15] Анализ проксимальных жидкостей может дать лучшее представление о секретоме опухоли человека, но этот метод также имеет свои недостатки. Процедуры сбора проксимальных жидкостей все еще нуждаются в стандартизации, а также необходим контроль доброкачественных заболеваний. Кроме того, экологические и генетические различия между пациентами могут усложнить анализ. [15]
Секретомный анализ обнаружил потенциальные новые биомаркеры многих типов рака, включая рак легких , рак печени , рак поджелудочной железы , колоректальный рак , рак простаты и рак молочной железы . Простатический специфический антиген (ПСА), современный стандартный биомаркер рака простаты, имеет низкую диагностическую специфичность – уровни ПСА не всегда позволяют отличить агрессивный и неагрессивный рак – и поэтому крайне необходим более совершенный биомаркер. Используя секретомный анализ линий клеток простаты, одно исследование смогло обнаружить несколько белков, обнаруженных в более высоких уровнях в сыворотке больных раком, чем у здоровых людей. [10]
Существует также большая потребность в биомаркерах для выявления рака молочной железы – в настоящее время биомаркеры существуют только для мониторинга более поздних стадий рака. [2] Секретомный анализ клеточных линий рака молочной железы привел к открытию белка ALCAM как нового биомаркера с многообещающим диагностическим потенциалом. [10]
Вспомогательные репродуктивные технологии
[ редактировать ]Анализ эмбрионального секретома человека может помочь в поиске неинвазивного метода определения жизнеспособности эмбрионов . При ЭКО эмбрионы оцениваются по морфологическим критериям в попытке найти эмбрионы с высоким потенциалом имплантации . Поиск более количественного метода оценки может помочь уменьшить количество эмбрионов, используемых при ЭКО, тем самым уменьшая количество беременностей более высокого порядка . Например, в одном исследовании удалось разработать секретомные отпечатки пальцев для многих бластоцист и обнаружить 9 белков, которые могли различать бластоцисты с нормальным и аномальным количеством хромосом . Этот тип анализа может помочь заменить преимплантационный генетический скрининг (ПГС), который включает биопсию эмбриональных клеток и может быть вреден для развития. [16]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д и ж г Хатхут, Йетриб (2007). «Подходы к изучению клеточного секретома». Экспертное обозрение по протеомике . 4 (2): 239–48. дои : 10.1586/14789450.4.2.239 . ПМИД 17425459 .
- ^ Jump up to: а б Павлова, Мария П.; Диамандис, Элефтериос П. (2010). «Секретом раковых клеток: хороший источник для обнаружения биомаркеров?». Журнал протеомики . 73 (10): 1896–906. дои : 10.1016/j.jprot.2010.04.003 . ПМИД 20394844 .
- ^ Гринборг, Мэдс; Кристиансен, Троэлс Захариас; Ивахори, Акико; Чанг, Рубенс; Редди, Рагунатх; Сато, Норихиро; Молина, Генри; Йенсен, Оле Норрегаард; Хрубан, Ральф Х. (январь 2006 г.). «Открытие биомаркеров секретома рака поджелудочной железы с использованием дифференциального протеомного подхода» . Молекулярная и клеточная протеомика . 5 (1): 157–171. дои : 10.1074/mcp.M500178-MCP200 . ISSN 1535-9476 . ПМИД 16215274 .
- ^ Хан, Мохд М.; Эрнст, Орна; Сунь, Цзин; Фрейзер, Иэн, округ Колумбия; Эрнст, Роберт К.; Гудлетт, Дэвид Р.; Нита-Лазар, Александра (24 июня 2018 г.). «Структурный анализ на основе масс-спектрометрии и стратегии системной иммунопротеомики для расшифровки ответа хозяина на эндотоксин». Журнал молекулярной биологии . 430 (17): 2641–2660. дои : 10.1016/j.jmb.2018.06.032 . ISSN 1089-8638 . ПМИД 29949751 .
- ^ Хан, Мохд М.; Коппенол-Рааб, Марийке; Куриакосе, Минна; Манес, Натан П.; Гудлетт, Дэвид Р.; Нита-Лазар, Александра (20 марта 2018 г.). «Динамика хозяина-патогена посредством целевого секретомного анализа стимулированных макрофагов» . Журнал протеомики . 189 : 34–38. дои : 10.1016/j.jprot.2018.03.016 . ISSN 1876-7737 . ПМК 6149218 . ПМИД 29572161 .
- ^ Хайнс, Р.О.; Наба, А. (21 сентября 2011 г.). «Обзор матрисомы - перечень компонентов и функций внеклеточного матрикса» . Перспективы Колд-Спринг-Харбор в биологии . 4 (1): а004903. doi : 10.1101/cshperspect.a004903 . ПМЦ 3249625 . ПМИД 21937732 .
- ^ Тьялсма, Х.; Болхуис, А.; Джонгблуд, JDH; Брон, С.; Ван Дейл, Дж. М. (2000). «Транспорт сигнальных пептид-зависимых белков в Bacillus subtilis: геномное исследование секретома» . Обзоры микробиологии и молекулярной биологии . 64 (3): 515–47. дои : 10.1128/MMBR.64.3.515-547.2000 . ПМК 99003 . ПМИД 10974125 .
- ^ Антельманн, Х.; Тьялсма, Х; Фойгт, Б; Ольмайер, С; Брон, С; Ван Дейл, Дж. М.; Хекер, М. (2001). «Протеомный взгляд на предсказания сигнальных пептидов на основе генома» . Геномные исследования . 11 (9): 1484–502. дои : 10.1101/гр.182801 . ПМИД 11544192 .
- ^ Jump up to: а б Агравал, Ганеш Кумар; Джва, Нам Су; Лебрен, Марк-Анри; Иов, Доминик; Раквал, Рандип (2010). «Секретом растений: раскрытие секретов секретируемых белков». Протеомика . 10 (4): 799–827. дои : 10.1002/pmic.200900514 . ПМИД 19953550 .
- ^ Jump up to: а б с д и Макридакис, Манусос; Влаху, Антония (2010). «Секретомная протеомика для открытия биомаркеров рака». Журнал протеомики . 73 (12): 2291–305. дои : 10.1016/j.jprot.2010.07.001 . ПМИД 20637910 .
- ^ Jump up to: а б Мустафа, Шахаван Абдулрахман; Хохайзель, Йорг Д.; Альхамдани, Мохамед Саил Саид (2011). «Профилирование секретома с помощью микрочипов антител». Молекулярные биосистемы . 7 (6): 1795–801. дои : 10.1039/c1mb05071k . ПМИД 21505656 .
- ^ Лам, Г.; Мин, XJ (2011). «FunSecKB: База знаний по секретомам грибов» . База данных . 2011 : бар001. дои : 10.1093/база данных/bar001 . ISSN 1758-0463 . ПМЦ 3263735 . ПМИД 21300622 .
- ^ Чжоу, Мяомяо; Теуниссен, Дэниел; Вельс, Михель; Зизен, Роланд Дж (2010). «LAB-Secretome: сравнительный анализ в масштабе генома предсказанных внеклеточных и поверхностно-ассоциированных белков молочнокислых бактерий» . БМК Геномика . 11 (1): 651. дои : 10.1186/1471-2164-11-651 . ISSN 1471-2164 . ПМК 3017865 . ПМИД 21092245 .
- ^ Полачек, Мартин; Брюун, Джек-Ансгар; Йохансен, Оддмунд; Мартинес, Иниго (2010). «Различия в секретоме хрящевых эксплантов и культивируемых хондроцитов, выявленные с помощью технологии SILAC» . Журнал ортопедических исследований . 28 (8): 1040–9. дои : 10.1002/jor.21067 . ПМИД 20108312 .
- ^ Jump up to: а б с Караяннис, Джордж С.; Павлова, Мария П.; Диамандис, Элефтериос П. (2010). «Секретомика рака раскрывает патофизиологические пути молекулярной онкологии рака» . Молекулярная онкология . 4 (6): 496–510. дои : 10.1016/j.molonc.2010.09.001 . ПМК 5527923 . ПМИД 20934395 .
- ^ Кац-Яффе, МГ; Макрейнольдс, С.; Гарднер, ДК; Скулкрафт, Всемирный банк (2009). «Роль протеомики в определении эмбрионального секретома человека» . Молекулярная репродукция человека . 15 (5): 271–7. doi : 10.1093/моль/gap012 . ПМК 2666223 . ПМИД 19223337 .