Отпечаток пептидной массы

В биоинформатике или отпечаток массы пептида карта массы пептида представляет собой масс-спектр смеси пептидов переваренного белка , получаемой из анализируемого . Масс-спектр служит «отпечатком пальца» в том смысле, что это образец, который может служить для идентификации белка. ^{[ 1 ]} Метод формирования отпечатка массы пептида, разработанный в 1993 году, состоит из выделения белка, его расщепления на отдельные пептиды и определения масс пептидов с помощью той или иной формы масс-спектрометрии. ^{[ 2 ]} После формирования отпечаток пептидной массы можно использовать для поиска в базах данных родственных белков или даже геномных последовательностей, что делает его мощным инструментом для аннотации генов, кодирующих белок. ^{[ 3 ]}

Одним из основных преимуществ массового дактилоскопирования является то, что его проведение значительно быстрее, чем секвенирование пептидов , но результаты одинаково полезны. ^{[ 4 ]} Недостатки включают необходимость использования одного белка для анализа и требование, чтобы последовательность белка находилась, по крайней мере, со значительной гомологией, в базе данных. Поскольку масса отдельных пептидов измеряется при формировании отпечатка пальца, смеси различных белков могут давать ненадежные результаты. Поэтому подготовка проб является важным этапом процесса. Даже в этом случае, если получены надежные результаты, в базе данных, которую вы ищете, должна быть соответствующая пептидная последовательность, чтобы результаты были полезными. ^{[ 5 ]}

Подготовка проб

Перед анализом с помощью масс-спектрометрии белок необходимо точно выделить и переварить. Если не выделить, результаты будут представлять собой смесь двух или более белков и, следовательно, будут ненадежными при идентификации белков. Из-за этой чувствительности подготовка проб, вероятно, является наиболее важным шагом в формировании отпечатка массы пептида.

Выделение конкретного белка чаще всего осуществляется с помощью гель-электрофореза , при котором белки разделяются по размеру и впоследствии могут быть экстрагированы для дальнейшего приготовления. Однако их также можно выделить с помощью жидкостной хроматографии . Этот метод также разделяет белки по размеру. ^{[ 6 ]}

После выделения отдельного белка его необходимо переварить и фракционировать для дальнейшего анализа с помощью спектрометра. Это делается путем добавления протеолитических ферментов, таких как трипсин и химотрипсин . ^{[ 7 ]}

Другой широко используемый метод, который сочетает в себе этапы выделения и расщепления, - это SDS-PAGE , форма электрофореза, которая одновременно разделяет и фракционирует белки.

Спектрометрический анализ

Переваренный белок можно анализировать с помощью масс-спектрометров различных типов, таких как ESI-TOF или MALDI-TOF . MALDI-TOF часто является предпочтительным инструментом, поскольку он обеспечивает высокую пропускную способность образцов и позволяет анализировать несколько белков в одном эксперименте, если он дополняется анализом MS/MS . ^{[ 8 ]}

При матричной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) образец фрагментированного пептида загружается на матрицу и ионизируется с помощью лазера высокой энергии. Затем фрагментированные ионы разделяются по соотношению массы к заряду на основе времени прохождения (TOF) через спектрометр. Затем их можно дополнительно фрагментировать и повторно проанализировать с помощью тандемной масс-спектрометрии, часто с использованием квадрупольной ионной ловушки . ^{[ 9 ]} но возможно и с тандемным временем полета. ^{[ 10 ]}

Выходные данные, полученные от масс-спектрометра, имеют форму списка пиков. Этот спектр показывает массы и относительное содержание пептидных фрагментов, присутствующих в образце. При чтении спектра, подобного показанному, необходимо учитывать все возможные основные фрагменты белка. Тогда массы этих фрагментов будут коррелировать с числами пиков спектра. Хотя его можно в некоторой степени проанализировать отдельно, при формировании отпечатка массы пептида список пиков прогоняется через поиск в базе данных, чтобы найти гомологичные пептидные последовательности.

Анализ компьютерной базы данных

Список пиков, полученный спектрометрическими методами, используется в качестве запроса при поиске в базе данных с использованием программного обеспечения MASCOT . ^{[ 11 ]} Программное обеспечение MASCOT использует алгоритм, который ищет значительную гомологию пептидной последовательности, чтобы на основе результатов представить наиболее статистически вероятный белок в образце.

При выполнении поиска вы сами выбираете базу данных, через которую будете проходить. К таким базам данных относятся, среди прочего, Swissprot, часто используемый при исследовании хорошо изученных организмов, таких как люди, мыши и дрожжи; и NCBinr для более общего и надежного поиска.

Подробное руководство по использованию программного обеспечения MASCOT можно найти по ссылке ниже.

Приложения

Использование отпечатка пептидной массы довольно широко распространено в протеомных исследованиях. Вот некоторые конкретные примеры того, как он использовался в полевых условиях:

Скрининг и характеристика активности амилазы и целлюлазы у психротолерантных дрожжей.

Авторы этого исследования стремились определить, какие дрожжи метаболически активны при более низких температурах и, следовательно, могут быть использованы в более холодных промышленных процессах. Они выращивали различные дрожжи на среде при разных температурах, затем определяли активность ферментов, разделяя белки на геле и считывая отдельные полосы. Путем поиска в базе данных они нашли интересующий фермент и обнаружили два отдельных дрожжа, которые имели более высокую активность при более низких температурах. ^{[ 12 ]}

APOA-I: возможный новый биомаркер метаболических побочных эффектов при первом эпизоде шизофрении

Авторы данного исследования стремились определить влияние на метаболизм препарата рисперидон у больных шизофренией. Обнаружив, что рисперидон действительно имеет отрицательные метаболические побочные эффекты, они протестировали мембранные белки на транспорт глюкозы и липидов в контрольной и экспериментальной группах с помощью MALDI-TOF и дактилоскопии. Результаты показали измененные отпечатки пальцев и, следовательно, измененные уровни сворачивания белков. Так, они пришли к выводу, что рисперидон отрицательно влияет на белки-переносчики глюкозы и липидов в клеточных мембранах пациентов. ^{[ 13 ]}

См. также

Ссылки

^ Масс-спектрометрия в биологических науках
^ Джеймс, П.; Квадрони, М.; Карафоли, Э.; Гонне, Г. (31 августа 1993 г.). «Идентификация белков методом дактилоскопии массового профиля». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 195 (1): 58–64. дои : 10.1006/bbrc.1993.2009 . ISSN 0006-291X . ПМИД 8363627 .
^ Коттрелл, Дж. С. (1 июня 1994 г.). «Идентификация белков методом массового дактилоскопирования пептидов». Пептидные исследования . 7 (3): 115–124. ISSN 1040-5704 . ПМИД 8081066 .
^ Паппин, диджей; Хойруп, П.; Блисби, Эй Джей (1 июня 1993 г.). «Быстрая идентификация белков с помощью дактилоскопии пептидной массы». Современная биология . 3 (6): 327–332. Бибкод : 1993CBio....3..327P . дои : 10.1016/0960-9822(93)90195-т . ISSN 0960-9822 . ПМИД 15335725 . S2CID 40203243 .
^ Хензель, Уильям Дж; Ватанабэ, Колин; Стултс, Джон Т. (1 сентября 2003 г.). «Идентификация белков: истоки массового снятия отпечатков пальцев пептидов». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 14 (9): 931–942. Бибкод : 2003JASMS..14..931H . дои : 10.1016/S1044-0305(03)00214-9 . ПМИД 12954162 .
^ «Узел EMBnet в Швейцарии» (PDF) . www.ch.embnet.org . Проверено 11 апреля 2016 г.
^ Йейтс, младший; Спейчер, С.; Гриффин, PR; Хункапиллер, Т. (1 ноября 1993 г.). «Карты пептидных масс: высокоинформативный подход к идентификации белков». Аналитическая биохимия . 214 (2): 397–408. дои : 10.1006/abio.1993.1514 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 8109726 .
^ Йейтс, младший (1 января 1998 г.). «Масс-спектрометрия и возраст протеома». Журнал масс-спектрометрии . 33 (1): 1–19. Бибкод : 1998JMSp...33....1Y . doi : 10.1002/(SICI)1096-9888(199801)33:1<1::AID-JMS624>3.0.CO;2-9 . ISSN 1076-5174 . ПМИД 9449829 .
^ Ахмед, Фарид Э. (1 декабря 2008 г.). «Применение масс-спектрометрии для анализа протеома: часть I. Концептуальные и экспериментальные подходы». Экспертное обозрение по протеомике . 5 (6): 841–864. дои : 10.1586/14789450.5.6.841 . ISSN 1744-8387 . ПМИД 19086863 . S2CID 38574652 .
^ Вестал, Марвин Л.; Кэмпбелл, Дженнифер М. (1 января 2005 г.). «Тандемная времяпролетная масс-спектрометрия». Биологическая масс-спектрометрия . Методы энзимологии. Том. 402. стр. 79–108. дои : 10.1016/S0076-6879(05)02003-3 . ISBN 9780121828073 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 16401507 .
^ Райт, Джеймс С.; Коллинз, Марк О.; Ю, Лу; Келл, Лукас; Брош, Маркус; Чоудхари, Джиоти С. (1 августа 2012 г.). «Улучшенная идентификация пептидов путем диссоциации с переносом электронов с использованием улучшенного перколятора Mascot» . Молекулярная и клеточная протеомика . 11 (8): 478–491. дои : 10.1074/mcp.O111.014522 . ISSN 1535-9484 . ПМК 3412976 . ПМИД 22493177 .
^ Карраско, Марио; Вильярреал, Пабло; Бараона, Сальвадор; Алькаино, Дженнифер; Сифуэнтес, Виктор; Баэса, Марсело (19 февраля 2016 г.). «Скрининг и характеристика активности амилазы и целлюлазы у психротолерантных дрожжей» . БМК Микробиология . 16:21 . дои : 10.1186/s12866-016-0640-8 . ISSN 1471-2180 . ПМЦ 4759947 . ПМИД 26895625 .
^ Сун, Сюэцинь; Ли, Сюэ; Гао, Цзиньсун; Чжао, Цзинпин; Ли, Юхуэй; Фань, Сяодуо; Льв, Луксиан (07 апреля 2014 г.). «APOA-I: возможный новый биомаркер метаболических побочных эффектов при первом эпизоде шизофрении» . ПЛОС ОДИН . 9 (4): е93902. Бибкод : 2014PLoSO...993902S . дои : 10.1371/journal.pone.0093902 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 3978061 . ПМИД 24710015 .

Внешние ссылки

[1] Масс-спектрометрия в биологических науках

[2] Джеймс, П.; Квадрони, М.; Карафоли, Э.; Гонне, Г. (31 августа 1993 г.). «Идентификация белков методом дактилоскопии массового профиля». Связь с биохимическими и биофизическими исследованиями . 195 (1): 58–64. дои : 10.1006/bbrc.1993.2009 . ISSN 0006-291X . ПМИД 8363627 .

[3] Коттрелл, Дж. С. (1 июня 1994 г.). «Идентификация белков методом массового дактилоскопирования пептидов». Пептидные исследования . 7 (3): 115–124. ISSN 1040-5704 . ПМИД 8081066 .

[4] Паппин, диджей; Хойруп, П.; Блисби, Эй Джей (1 июня 1993 г.). «Быстрая идентификация белков с помощью дактилоскопии пептидной массы». Современная биология . 3 (6): 327–332. Бибкод : 1993CBio....3..327P . дои : 10.1016/0960-9822(93)90195-т . ISSN 0960-9822 . ПМИД 15335725 . S2CID 40203243 .

[5] Хензель, Уильям Дж; Ватанабэ, Колин; Стултс, Джон Т. (1 сентября 2003 г.). «Идентификация белков: истоки массового снятия отпечатков пальцев пептидов». Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 14 (9): 931–942. Бибкод : 2003JASMS..14..931H . дои : 10.1016/S1044-0305(03)00214-9 . ПМИД 12954162 .

[6] «Узел EMBnet в Швейцарии» (PDF) . www.ch.embnet.org . Проверено 11 апреля 2016 г.

[7] Йейтс, младший; Спейчер, С.; Гриффин, PR; Хункапиллер, Т. (1 ноября 1993 г.). «Карты пептидных масс: высокоинформативный подход к идентификации белков». Аналитическая биохимия . 214 (2): 397–408. дои : 10.1006/abio.1993.1514 . ISSN 0003-2697 . ПМИД 8109726 .

[8] Йейтс, младший (1 января 1998 г.). «Масс-спектрометрия и возраст протеома». Журнал масс-спектрометрии . 33 (1): 1–19. Бибкод : 1998JMSp...33....1Y . doi : 10.1002/(SICI)1096-9888(199801)33:1<1::AID-JMS624>3.0.CO;2-9 . ISSN 1076-5174 . ПМИД 9449829 .

[9] Ахмед, Фарид Э. (1 декабря 2008 г.). «Применение масс-спектрометрии для анализа протеома: часть I. Концептуальные и экспериментальные подходы». Экспертное обозрение по протеомике . 5 (6): 841–864. дои : 10.1586/14789450.5.6.841 . ISSN 1744-8387 . ПМИД 19086863 . S2CID 38574652 .

[10] Вестал, Марвин Л.; Кэмпбелл, Дженнифер М. (1 января 2005 г.). «Тандемная времяпролетная масс-спектрометрия». Биологическая масс-спектрометрия . Методы энзимологии. Том. 402. стр. 79–108. дои : 10.1016/S0076-6879(05)02003-3 . ISBN 9780121828073 . ISSN 0076-6879 . ПМИД 16401507 .

[11] Райт, Джеймс С.; Коллинз, Марк О.; Ю, Лу; Келл, Лукас; Брош, Маркус; Чоудхари, Джиоти С. (1 августа 2012 г.). «Улучшенная идентификация пептидов путем диссоциации с переносом электронов с использованием улучшенного перколятора Mascot» . Молекулярная и клеточная протеомика . 11 (8): 478–491. дои : 10.1074/mcp.O111.014522 . ISSN 1535-9484 . ПМК 3412976 . ПМИД 22493177 .

[12] Карраско, Марио; Вильярреал, Пабло; Бараона, Сальвадор; Алькаино, Дженнифер; Сифуэнтес, Виктор; Баэса, Марсело (19 февраля 2016 г.). «Скрининг и характеристика активности амилазы и целлюлазы у психротолерантных дрожжей» . БМК Микробиология . 16:21 . дои : 10.1186/s12866-016-0640-8 . ISSN 1471-2180 . ПМЦ 4759947 . ПМИД 26895625 .

[13] Сун, Сюэцинь; Ли, Сюэ; Гао, Цзиньсун; Чжао, Цзинпин; Ли, Юхуэй; Фань, Сяодуо; Льв, Луксиан (07 апреля 2014 г.). «APOA-I: возможный новый биомаркер метаболических побочных эффектов при первом эпизоде шизофрении» . ПЛОС ОДИН . 9 (4): е93902. Бибкод : 2014PLoSO...993902S . дои : 10.1371/journal.pone.0093902 . ISSN 1932-6203 . ПМЦ 3978061 . ПМИД 24710015 .

[ 1 ]

[ 2 ]

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]