Метка сродства с изотопной кодировкой
Аффинная метка с изотопным кодированием ( ICAT ) — это in vitro, метод изотопной маркировки используемый для количественной протеомики с помощью масс-спектрометрии , в которой используются реагенты для химической маркировки. [1] [2] [3] Эти химические зонды состоят из трех элементов: реактивной группы для мечения боковой цепи аминокислоты (например, йодацетамида для модификации остатков цистеина ), изотопно-кодируемого линкера и метки (например, биотина ) для аффинного выделения меченых белков/пептидов. . Образцы объединяют, затем разделяют с помощью хроматографии, а затем пропускают через масс-спектрометр для определения соотношения массы к заряду между белками. Анализировать можно только цистеинсодержащие пептиды. Поскольку анализируются только цистеинсодержащие пептиды, посттрансляционная модификация часто теряется. [4]
Разработка
[ редактировать ]Первоначальные метки были разработаны с использованием дейтерия , но позже та же группа переработала метки, используя вместо них 13C , чтобы обойти проблемы разделения пиков во время жидкостной хроматографии из-за взаимодействия дейтерия с неподвижной фазой колонки. [5]
Количественная протеомика
[ редактировать ]Для количественного сравнения двух протеомов один образец метят изотопно-легким (d0) зондом, а другой - изотопно-тяжелым (d8). Чтобы свести к минимуму ошибку, оба образца затем объединяют, расщепляют протеазой ( т.е. трипсином ) и подвергают авидиновой аффинной хроматографии для выделения пептидов, меченных изотопно-кодированными мечеными реагентами. Эти пептиды затем анализируют с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС). Соотношения интенсивностей сигналов пар пептидов с дифференциальной массой мечены количественно для определения относительных уровней белков в двух образцах.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Коланджело, Кристофер М.; Уильямс, Кеннет Р. (2006). «Аффинные метки с изотопным кодированием для количественного определения белка». Новые и перспективные протеомные методы . Методы молекулярной биологии. Том. 328. С. 151–158 . дои : 10.1385/1-59745-026-X:151 . ISBN 978-1-59745-026-3 . ПМИД 16785647 .
- ^ Гиги С.П., Рист Б., Гербер С.А., Туречек Ф., Гелб М.Х., Эберсолд Р. (октябрь 1999 г.). «Количественный анализ сложных белковых смесей с использованием аффинных меток, закодированных изотопами». Природная биотехнология . 17 (10): 994–9. дои : 10.1038/13690 . ПМИД 10504701 .
- ^ США 6670194 , Эберсольд, Рудольф Ганс; Гелб, Майкл Х. и Гиги, Стивен П. и др., «Быстрый количественный анализ белков или функций белков в сложных смесях», опубликовано 30 декабря 2003 г., передано Вашингтонскому университету.
- ^ «iCAT» . Протеомика . Проверено 7 июня 2020 г.
- ^ Йи, ЕС; и др. (2005). «Увеличенное количественное покрытие протеома с помощью кислотно-расщепляемого реагента с изотопно-кодированной аффинной меткой на основе (13) C/(12) C и модифицированной схемы сбора данных». Протеомика . 5 (2): 380–7. дои : 10.1002/pmic.200400970 . ПМИД 15648049 .