Изобарная маркировка
Изобарное мечение — это стратегия масс-спектрометрии, используемая в количественной протеомике . Пептиды или белки помечены химическими группами, которые имеют (по крайней мере номинально) одинаковую массу (изобарическую), но различаются распределением тяжелых изотопов в своей структуре. Эти метки, обычно называемые тандемными масс-метками, сконструированы таким образом, что массовая метка расщепляется в определенной области линкера при высокоэнергетическом CID (HCD) во время тандемной масс-спектрометрии, давая репортерные ионы различной массы. Наиболее распространенными изобарными метками являются метки, реагирующие на амины. [1] Однако описаны также метки, реагирующие с остатками цистеина и карбонильными группами. [2] Эти реагирующие с амином группы вступают в реакции N-гидроксисукцинимида (NHS) , которые основаны на трех типах функциональных групп. [2] Методы изобарной маркировки включают тандемные массовые метки (TMT) , изобарические метки для относительного и абсолютного количественного определения (iTRAQ) , метки дифференциальной массы для абсолютного и относительного количественного определения и диметиловое мечение. [1] Методы TMT и iTRAQ являются наиболее распространенными и развитыми из этих методов. [1] Тандемные массовые метки имеют репортерную область массы, расщепляемую линкерную область, область нормализации массы и группу, реагирующую с белком, и имеют одинаковую общую массу. [3]
Рабочий процесс
[ редактировать ]Типичный восходящий рабочий процесс протеомики описан (Yates, 2014). [2] Образцы белка ферментативно расщепляются протеазой с образованием пептидов. Каждый переваренный экспериментальный образец является производным с другим изотопным вариантом метки из набора. Образцы обычно смешивают в равных пропорциях и анализируют одновременно за один цикл МС. Поскольку метки являются изобарными и имеют идентичные химические свойства, изотопные варианты меток проявляются как один составной пик с одинаковым значением m/z при сканировании MS1 с идентичным временем удерживания жидкостной хроматографией (ЖХ). Во время анализа MS2 и после фрагментации каждый изотопный вариант метки производит ионы-продукты, специфичные для последовательности. Эти ионы-продукты используются для определения последовательности пептида и репортерных меток, содержание которых отражает относительное соотношение пептида в объединенных образцах. Для обнаружения меток требуется использование МС/МС, поэтому количественное определение немеченых пептидов не проводится.
Преимущества
[ редактировать ]Объяснено ранее (Lee, Choe, Aggarwal, 2017). [4] Ключевым преимуществом изобарной маркировки по сравнению с другими методами количественного определения (например, без меток) являются возможности мультиплексирования и, следовательно, увеличенный потенциал пропускной способности. Возможность объединять и анализировать несколько образцов одновременно в одном цикле ЖХ-МС устраняет необходимость анализа нескольких наборов данных и устраняет различия между сериями. Мультиплексирование снижает вариабельность обработки образцов, повышает специфичность за счет одновременного количественного определения пептидов в каждом состоянии и сокращает время обработки нескольких образцов. Без мультиплексирования информация может быть пропущена от серии к серии, что повлияет на идентификацию и количественную оценку, поскольку пептиды, выбранные для фрагментации в одном цикле ЖХ-МС/МС, могут отсутствовать или отсутствовать в подходящем количестве в последующих сериях проб. Доступные в настоящее время изобарные химические метки позволяют одновременно анализировать от 2 до 11 экспериментальных образцов.
Приложения
[ редактировать ]
Изобарное мечение успешно используется для многих биологических применений, включая идентификацию и количественную оценку белков, профилирование экспрессии белков в нормальных и аномальных состояниях, количественный анализ белков, к которым нет антител, а также идентификацию и количественную оценку посттрансляционно модифицированных белков. [4]
Доступность
[ редактировать ]В продаже имеются изобарические метки двух типов: тандемные массовые метки (TMT) и изобарные метки для относительного и абсолютного количественного анализа (iTRAQ) . Амин-реактивные ТМТ доступны в дуплексных, 6-плексных и 10-плексных, а теперь и в 11-плексных наборах. [5] Амин-реактивный iTRAQ доступен в 4-плексном и 8-плексном исполнении. [6] формы.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с Банщефф, Маркус; Лемер, Симона; Савицкий Михаил М.; Кастер, Бернхард (1 сентября 2012 г.). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: обновление критического обзора с 2007 года по настоящее время». Аналитическая и биоаналитическая химия . 404 (4): 939–965. дои : 10.1007/s00216-012-6203-4 . ISSN 1618-2650 . ПМИД 22772140 . S2CID 21085313 .
- ^ Jump up to: а б с Йейтс, Джон (2014). «Относительная количественная оценка на основе изобарной маркировки в протеомике дробовика» . Журнал исследований протеома . 13 (12): 5293–5309. дои : 10.1021/pr500880b . ПМК 4261935 . ПМИД 25337643 .
- ^ Томпсон, Эндрю; Шефер, Юрген; Кун, Карстен; Кинле, Стефан; Блэк, Джозеф; Шмидт, Гюнтер; Нойманн, Томас; Хамон, Кристиан (2003). «Тандемные массовые метки: новая стратегия количественного определения для сравнительного анализа сложных белковых смесей методом МС/МС». Аналитическая химия . 75 (8): 1895–1904. дои : 10.1021/ac0262560 . ISSN 0003-2700 . ПМИД 12713048 . S2CID 30820837 .
- ^ Jump up to: а б Ли, Кельвин Х.; Чоу, Лейла Х.; Аггарвал, Кунал (1 июня 2006 г.). «Протеомика дробовика с использованием изобарических меток iTRAQ» . Брифинги по функциональной геномике . 5 (2): 112–120. дои : 10.1093/bfgp/ell018 . ISSN 2041-2649 . ПМИД 16772272 .
- ^ Дайон Л., Хайнард А., Ликер В., Терк Н., Кун К., Хохштрассер Д.Ф., Буркхард П.Р., Санчес Дж.К. (2008). «Относительное количественное определение белков в спинномозговой жидкости человека методом МС/МС с использованием 6-плексных изобарических меток». Анальный. Хим . 80 (8): 2921–31. дои : 10.1021/ac702422x . ПМИД 18312001 . S2CID 12362045 .
- ^ Чой Л., Д'Асензо М., Релкин Н.Р., Паппин Д., Росс П., Уильямсон Б., Гертин С., Прибил П., Ли К.Х. (2007). «8-плексное количественное определение изменений в экспрессии белков спинномозговой жидкости у субъектов, проходящих внутривенное лечение иммуноглобулинами по поводу болезни Альцгеймера» . Протеомика . 7 (20): 3651–60. дои : 10.1002/pmic.200700316 . ПМЦ 3594777 . ПМИД 17880003 .