Тандемная массовая метка
Тандемная масс-метка ( ТМТ ) — это химическая метка, которая облегчает мультиплексирование образцов при на основе масс-спектрометрии количественном определении и идентификации биологических макромолекул, таких как белки , пептиды и нуклеиновые кислоты, (МС) . ТМТ принадлежит к семейству реагентов, называемых метками изобарной массы , которые представляют собой набор молекул с одинаковой массой, но после фрагментации дают репортерные ионы разной массы. Относительное соотношение измеренных репортерных ионов представляет собой относительное содержание меченой молекулы, хотя подавление ионов отрицательно влияет на точность. [1] [2] Несмотря на эти сложности, было показано, что протеомика на основе ТМТ обеспечивает более высокую точность, чем количественный анализ без меток . [3] Помимо помощи в количественном определении белка, метки ТМТ также могут повысить чувствительность обнаружения некоторых высокогидрофильных аналитов, таких как фосфопептиды, в RPLC -MS. анализах [4]
Версии
[ редактировать ]В настоящее время доступно шесть разновидностей ТМТ: TMTzero, неизотопно-замещенная основная структура; TMTduplex — изобарная пара масс-меток с одним изотопным замещением; [5] TMTsixplex, изобарный набор из шести массовых меток с пятью изотопными заменами; [6] [ нужен неосновной источник ] TMT 10-plex - набор из 10 изотопных масс-меток, которые используют репортерную область TMTsixplex, но используют другой элементный изотоп для создания разницы масс 0,0063 Да, [7] [ нужен неосновной источник ] TMTpro - 16-плексная версия с другим репортером и нормализатором массы, чем исходные TMT и TMTpro Zero.
| Массовый сдвиг | |
|---|---|
| ТМТ 0 | 224.152478 |
| ТМТ 2 | 225.155833 |
| ТМТ 6/10 | 229.162932 |
| ТМТ 11 | 229.169252 |
| ТМТ Про-ноль | 295.18959 |
| ТМТ Про | 304.2071 |
Метки содержат четыре области, а именно область массового репортера (M), область расщепляемого линкера (F), область нормализации массы (N) и группу, реагирующую с белком (R). Химические структуры всех меток идентичны, но каждая содержит изотопы, замещенные в разных положениях, так что области репортера массы и области нормализации массы имеют разные молекулярные массы в каждой метке. Комбинированные области меток MFNR имеют одинаковую общую молекулярную массу и структуру, поэтому во время хроматографического или электрофоретического разделения и в режиме одиночного МС молекулы, меченные разными метками, неразличимы. При фрагментации в режиме МС/МС информация о последовательности получается в результате фрагментации пептидного остова , а данные количественного определения одновременно получаются в результате фрагментации меток, что приводит к образованию массы репортерных ионов.
Количественное определение меченых пептидов
[ редактировать ]Структуры программное обеспечение для тегов TMT общедоступны через базу данных unimod на unimod.org, и, следовательно, масс-спектрометрии, такое как Mascot, может учитывать массы тегов. Кроме того, начиная с версии 2.2, Mascot имеет возможность проводить количественную оценку с использованием TMT и других изобарических меток массы без использования дополнительного программного обеспечения. Интуитивно понятно, что доверие, связанное с измерением белка, зависит от сходства соотношений разных пептидов и уровня сигнала этих измерений. Появился математически строгий подход под названием BACIQ, который объединяет интенсивности пептидов и согласованность измерений пептидов в доверительные интервалы для соотношений белков. [8] Стандарт TKO можно использовать для оценки помех [9] [ нужен неосновной источник ]
Концепция изобарного носителя
[ редактировать ]Метки TMT обычно используются для маркировки образцов одинакового содержания. Однако если один из меченых образцов окажется более многочисленным, это может повысить чувствительность анализа для всех образцов. [10] Такие изобарно-меченные образцы называются изобарными носителями. Они были введены для анализа белков отдельных клеток методом масс-спектрометрии. [11] и нашли много других применений. [12]
Ссылки
[ редактировать ]- ^ О'Брайен Дж.Дж., О'Коннелл Дж.Д., Пауло Дж.А., Такурта С., Роуз К.М., Уикс М.П. и др. (январь 2018 г.). «Композиционная протеомика: влияние пространственных ограничений на количественный анализ белка с использованием изобарических меток» . Журнал исследований протеома . 17 (1): 590–599. doi : 10.1021/acs.jproteome.7b00699 . ПМК 5806995 . ПМИД 29195270 .
- ^ Бренес А., Хукельманн Дж., Бенсаддек Д., Ламонд А.И. (октябрь 2019 г.). «Многопакетный TMT выявляет ложные срабатывания, пакетные эффекты и пропущенные значения» . Молекулярная и клеточная протеомика . 18 (10): 1967–1980. дои : 10.1074/mcp.RA119.001472 . ПМК 6773557 . ПМИД 31332098 .
- ^ О'Коннелл Дж.Д., Пауло Дж.А., О'Брайен Дж.Дж., Гиги С.П. (май 2018 г.). «Протеомная оценка двух распространенных методов количественного определения белка» . Журнал исследований протеома . 17 (5): 1934–1942. doi : 10.1021/acs.jproteome.8b00016 . ПМЦ 5984592 . ПМИД 29635916 .
- ^ Цай К.Ф., Смит Дж.С., Краевски К., Чжао Р., Могиб А.М., Никора К.Д. и др. (сентябрь 2019 г.). «Метки тандемной массовой меткой облегчают анализ гидрофильных фосфопептидов с помощью обращенно-фазовой жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии» . Аналитическая химия . 91 (18): 11606–11613. дои : 10.1021/acs.analchem.9b01814 . ПМК 7197904 . ПМИД 31418558 .
- ^ Томпсон А., Шефер Дж., Кун К., Кинле С., Шварц Дж., Шмидт Г. и др. (апрель 2003 г.). «Тандемные массовые метки: новая стратегия количественного определения для сравнительного анализа сложных белковых смесей методом МС/МС». Аналитическая химия . 75 (8): 1895–904. дои : 10.1021/ac0262560 . ПМИД 12713048 .
- ^ Дайон Л., Хайнард А., Ликер В., Терк Н., Кун К., Хохштрассер Д.Ф. и др. (апрель 2008 г.). «Относительное количественное определение белков в спинномозговой жидкости человека методом МС/МС с использованием 6-плексных изобарических меток». Аналитическая химия . 80 (8): 2921–31. дои : 10.1021/ac702422x . ПМИД 18312001 .
- ^ Вернер Т., Свитман Г., Савицкий М.Ф., Мэтисон Т., Банщефф М., Савицкий М.М. (апрель 2014 г.). «Ионная коалесценция 10-плексных репортерных ионов, кодируемых нейтронами ТМТ». Аналитическая химия . 86 (7): 3594–601. дои : 10.1021/ac500140s . ПМИД 24579773 .
- ^ Пешкин Л.; Рязанова Л.; Вур, М.; и др. (2017). «Байесовские доверительные интервалы для мультиплексной протеомики объединяют ионную статистику с согласованием количественного определения пептидов». биоRxiv 10.1101/210476 .
- ^ Пауло Дж. А., О'Коннелл Дж. Д., Джиджи С. П. (октябрь 2016 г.). «Протеомный стандарт тройного нокаута (TKO) для диагностики ионной интерференции в экспериментах по изобарному мечению» . Журнал Американского общества масс-спектрометрии . 27 (10): 1620–5. Бибкод : 2016JASMS..27.1620P . дои : 10.1007/s13361-016-1434-9 . ПМК 5018445 . ПМИД 27400695 .
- ^ Шпехт Х., Славов Н. (январь 2021 г.). «Оптимизация точности и глубины количественного определения белка в экспериментах с использованием изобарных носителей» . Журнал исследований протеома . 20 (1): 880–887. doi : 10.1021/acs.jproteome.0c00675 . ПМЦ 7775882 . ПМИД 33190502 .
- ^ Будник Б., Леви Э., Харманж Г., Славов Н. (октябрь 2018 г.). «SCoPE-MS: масс-спектрометрия отдельных клеток млекопитающих количественно определяет гетерогенность протеома во время дифференцировки клеток» . Геномная биология . 19 (1): 161. дои : 10.1186/s13059-018-1547-5 . ПМК 6196420 . ПМИД 30343672 .
- ^ Славов Н. (февраль 2021 г.). «Анализ одноклеточных белков методом масс-спектрометрии» . Современное мнение в области химической биологии . 60 : 1–9. arXiv : 2004.02069 . дои : 10.1016/j.cbpa.2020.04.018 . ПМЦ 7767890 . ПМИД 32599342 .