Количественный анализ без меток
Количественная оценка без меток — это метод масс-спектрометрии , целью которого является определение относительного количества белков в двух или более биологических образцах. В отличие от других методов количественного определения белка , при количественном определении без метки не используется соединение, содержащее стабильный изотоп , для химического связывания и, таким образом, маркировки белка. [1] [2]
Выполнение
[ редактировать ]
Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала-предшественника или на спектральном подсчете . Первый метод полезен при применении к масс-спектрам высокой точности, например, полученным с использованием времяпролетного анализатора нового поколения (ToF), ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FTICR) или масс-анализаторов Orbitrap . Мощность высокого разрешения облегчает извлечение пептидных сигналов на МС. 1 уровне и, таким образом, отделяет количественную оценку от процесса идентификации. Напротив, спектральный подсчет просто подсчитывает количество спектров, идентифицированных для данного пептида в различных биологических образцах, а затем объединяет результаты для всех измеренных пептидов белка(ов), которые подвергаются количественной оценке.
Вычислительная основа подхода без меток включает в себя обнаружение пептидов, сопоставление соответствующих пептидов по множественным данным ЖХ-МС, выбор дискриминационных пептидов. [3] [4]
США Спектрометрия экспрессии интактных белков (IPEx) — это метод количественного определения без меток в масс-спектрометрии, который разрабатывается группой аналитической химии в Центре безопасности пищевых продуктов и прикладного питания Управления по контролю за продуктами и лекарствами и в других местах. Интактные белки анализируются с помощью прибора LCMS , обычно квадрупольного времяпролетного прибора в режиме профиля, а полный профиль белка определяется и количественно оценивается с использованием программного обеспечения для обработки данных. Первые результаты очень обнадеживают. В одном исследовании две группы повторов лечения из образцов млекопитающих (разные организмы со схожей историей лечения, но не техническими повторами) показали десятки биомаркеров белка с низким CV, что позволяет предположить, что IPEx является жизнеспособной технологией для изучения экспрессии белка. [5]
Обнаружение пептидов
[ редактировать ]Обычно сигналы пептидов обнаруживаются на уровне MS1 и отличаются от химического шума благодаря характерному изотопному паттерну. Эти закономерности затем отслеживаются по времени удерживания и используются для восстановления профиля хроматографического элюирования моноизотопной пептидной массы. Затем общий ионный ток сигнала пептида интегрируется и используется в качестве количественного измерения исходной концентрации пептида. Для каждого обнаруженного пептида сначала обнаруживаются все изотопные пики, а затем присваивается зарядовое состояние.
Количественная оценка без метки может быть основана на интенсивности сигнала предшественника и имеет проблемы из-за помех при изоляции: в высокопроизводительных исследованиях ион-предшественник пептида, который измеряется, может легко быть совершенно другим пептидом с аналогичным соотношением m/z, который элюируется в сроки, перекрывающиеся с периодами времени предыдущего пептида. Спектральный подсчет вызывает проблемы из-за того, что пептиды идентифицируются, что приводит к необходимости проведения дополнительного МС/МС-сканирования, которое требует времени и, следовательно, снижает разрешающую способность эксперимента.
Сопоставление соответствующих пептидов
[ редактировать ]В отличие от дифференциальной маркировки, каждый биологический образец необходимо измерять отдельно в эксперименте без маркировки. Извлеченные пептидные сигналы затем сопоставляются с помощью нескольких или нескольких измерений ЖХ-МС с использованием их координат по измерениям массы-заряда и времени удерживания. Данные, полученные от приборов высокой точности, значительно облегчают этот процесс и повышают уверенность в совпадении правильных сигналов пептидов во всех сериях.
Очевидно, что дифференцированная обработка биологических образцов требует наличия стандарта, который можно использовать для корректировки результатов. Для этой цели можно использовать пептиды, уровень экспрессии которых не будет меняться в различных биологических образцах. Однако не все пептиды хорошо ионизируются, и поэтому выбор кандидатов должен осуществляться после первоначального исследования, которое должно лишь характеризовать содержание белка в биологических образцах, которые будут исследоваться.
Выбор дискриминационных пептидов
[ редактировать ]Наконец, для удаления систематических артефактов в значениях интенсивности пептидов между измерениями ЖХ-МС используются сложные методы нормализации. Затем дискриминирующие пептиды идентифицируются путем выбора пептидов, нормализованная интенсивность которых различна (например, значение p <0,05) среди нескольких групп образцов.
Кроме того, новые гибридные масс-спектрометры, такие как LTQ OrbiTrap, дают возможность проводить идентификацию пептидов методом MS/MS параллельно с высокоточным массовым измерением пептидов на уровне MS1. Это поднимает вычислительную задачу для обработки и интеграции этих двух источников информации и привело к разработке новых многообещающих стратегий количественной оценки.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Банщефф М., Ширле М., Свитман Г., Рик Дж., Кастер Б. (октябрь 2007 г.). «Количественная масс-спектрометрия в протеомике: критический обзор» . Аналитическая и биоаналитическая химия . 389 (4): 1017–31. дои : 10.1007/s00216-007-1486-6 . ПМИД 17668192 .
- ^ Асара Дж. М., Кристофк Х. Р., Фреймарк Л. М., Кантли Л. С. (март 2008 г.). «Метод количественного определения без меток с помощью MS / MS TIC по сравнению с SILAC и спектральным подсчетом на протеомном скрининге» . Протеомика . 8 (5): 994–9. дои : 10.1002/pmic.200700426 . ПМИД 18324724 .
- ^ Бриджес С.М., Маги ГБ, Ван Н., Уильямс В.П., Берджесс СК, Нандури Б (2007). «ProtQuant: инструмент для количественной оценки протеомных данных MudPIT без меток» . БМК Биоинформатика . 8 (Приложение 7): S24. дои : 10.1186/1471-2105-8-S7-S24 . ПМК 2099493 . ПМИД 18047724 .
- ^ Лукас Н. Мюллер; и др. (2008). «Оценка программных решений для анализа данных количественной протеомики на основе масс-спектрометрии». Журнал исследований протеома . 7 (1): 51–61. CiteSeerX 10.1.1.336.4416 . дои : 10.1021/pr700758r . ПМИД 18173218 .
- ^ Шолль, П.Ф., Стратегия ЖХ/МС интактного белка для разработки биомаркеров сыворотки: Биомаркеры чувствительности печени к химиопрофилактическому лечению тритерпеноидом CDDO-Im , Аннотация , TOA, 8:35, конференция ASMS, 2007.