Двумерный гель-электрофорез
Двумерный гель-электрофорез , сокращенно 2-DE или 2-D электрофорез , представляет собой форму гель-электрофореза , обычно используемую для анализа белков . Смеси белков разделяются по двум свойствам в двух измерениях на 2D-гелях. 2-DE был впервые независимо представлен О'Фарреллом. [1] и Клозе [2] в 1975 году.
Основание для разделения
[ редактировать ]2-D электрофорез начинается с электрофореза в первом измерении, а затем молекулы разделяются перпендикулярно первому, чтобы создать электрофореграмму во втором измерении. При электрофорезе в первом измерении молекулы разделяются линейно в соответствии с их изоэлектрической точкой. Затем во втором измерении молекулы разделяются под углом 90 градусов от первой электрофореграммы в соответствии с молекулярной массой. Поскольку маловероятно, что две молекулы будут схожи по двум различным свойствам, молекулы разделяются более эффективно при 2-D электрофорезе, чем при 1-D электрофорезе. [ нужна ссылка ]
Двумя измерениями, на которые белки разделяются с помощью этого метода, могут быть изоэлектрическая точка , масса белкового комплекса в нативном состоянии или масса белка . [ нужна ссылка ]
- Разделение по изоэлектрической точке называется изоэлектрической фокусировкой . Таким образом, к гелю прикладывается градиент pH, и к гелю прикладывается электрический потенциал, делая один конец более положительным, чем другой. При всех значениях pH, отличных от их изоэлектрической точки, белки будут заряжены. Если они заряжены положительно, они будут притянуты к более отрицательному концу геля, а если они заряжены отрицательно, они будут притянуты к более положительному концу геля. Белки, нанесенные в первом измерении, будут двигаться по гелю и накапливаться в своей изоэлектрической точке; то есть точка, в которой общий заряд белка равен 0 (нейтральный заряд).
- Разделение по массе белкового комплекса осуществляется с помощью нативного ПААГ , при котором белки остаются в нативном состоянии и разделяются в электрическом поле по их массе и массе их комплексов соответственно. Чтобы добиться разделения по размеру, а не по суммарному заряду, как в ИЭФ, к белкам переносится дополнительный заряд с помощью кумасси бриллиантового синего или додецилсульфата лития. Знание белкового комплекса важно для анализа функционирования белков в клетке , поскольку белки в основном действуют вместе в комплексах, чтобы быть полностью функциональными. Анализ этой суборганоидной организации клетки требует методов, сохраняющих нативное состояние белковых комплексов .
- Разделение по массе обычно достигается с помощью SDS-PAGE . ДСН денатурирует белки, разрушает большинство комплексов и примерно выравнивает соотношение массы к заряду. SDS должен выполняться как второе, перпендикулярное измерение, поскольку оно разрушает комплексы (делает невозможным собственный PAGE) и уравнивает отношения массы к заряду (делает невозможным IEF).
Обнаружение белков
[ редактировать ]В результате получается гель с распределенными по поверхности белками. Эти белки затем можно обнаружить различными способами, но наиболее часто используемыми красителями являются окрашивание серебром и кумасси бриллиантовым синим. В первом случае на гель наносится коллоид серебра. Серебро связывается с цистеиновыми группами внутри белка. Серебро темнеет под воздействием ультрафиолета. Количество серебра может быть связано с темнотой и, следовательно, с количеством белка в данном месте геля. Это измерение может дать только приблизительные суммы, но достаточно для большинства целей. Окрашивание серебром в 100 раз более чувствительно, чем окрашивание бриллиантовым синим Кумасси, с диапазоном линейности в 40 раз. [3]
Молекулы, отличные от белков, можно разделить с помощью 2D-электрофореза. В суперспирализации анализах спиральная ДНК разделяется в первом измерении и денатурируется интеркалятором ДНК (таким как бромид этидия или менее канцерогенный хлорохин ) во втором. Это сравнимо с комбинацией нативного ПААГ/ДСН-ПААГ при разделении белков. [ нужна ссылка ]
Общие методы
[ редактировать ] | Этот раздел может потребовать очистки Википедии , чтобы соответствовать стандартам качества . Конкретная проблема заключается в следующем: подождите секундочку, изоэлектрическая фокусировка также использует IPG в своей статье, а за ней также следует SDS. В чем реальная разница, если она есть? ( декабрь 2023 г. ) |
ИПГ-ДАЛЬТ
[ редактировать ]Распространенным методом является использование иммобилизованного градиента pH (IPG) в первом измерении. Этот метод называется IPG-DALT . Образец сначала разделяют на гель IPG (который имеется в продаже), затем гель разрезают на кусочки для каждого образца, который затем уравновешивают в SDS-меркаптоэтаноле и наносят на гель SDS-PAGE для разделения во втором измерении. Обычно IPG-DALT не используется для количественного определения белков из-за потери низкомолекулярных компонентов во время переноса в гель SDS-PAGE. [4]
SDS-СТРАНИЦА МЭФ
[ редактировать ]См. Изоэлектрическую фокусировку.
Программное обеспечение для 2D-анализа гелей
[ редактировать ]
В количественной протеомике эти инструменты в первую очередь анализируют биомаркеры путем количественного определения отдельных белков и демонстрации разделения между одним или несколькими белковыми «пятнами» на сканированном изображении геля 2-DE. Кроме того, эти инструменты сопоставляют пятна между гелями схожих образцов, чтобы показать, например, протеомные различия между ранними и поздними стадиями заболевания. Пакеты программного обеспечения включают, среди прочего, Delta2D (снято с производства), ImageMaster (снято с производства), Melanie, PDQuest (снято с производства), SameSpots и REDFIN. [ нужна ссылка ] Хотя эта технология широко используется, интеллект еще не усовершенствован. Например, хотя PDQuest и SameSpots, как правило, согласны в количественном определении и анализе четко определенных и хорошо разделенных белковых пятен, они дают разные результаты и тенденции анализа с менее определенными и менее разделенными пятнами. [5] Ранее были опубликованы сравнительные исследования, призванные помочь исследователям выбрать «лучшее» программное обеспечение для анализа. [6] Хотя Sciugo обычно используется для стандартного гель-электрофореза , его также можно использовать для создания фигур и количественного анализа. [ нужна ссылка ]
Проблемы автоматического программного анализа включают не полностью разделенные (перекрывающиеся) пятна (менее определенные или разделенные), слабые места/шум (например, «призрачные пятна»), различия между гелями (например, белок мигрирует в разные положения в разных гелях). ), несовпадающие/необнаруженные места, что приводит к пропущенным значениям , [7] [8] несовпадающие пятна, ошибки в количественном определении (несколько различных пятен могут быть ошибочно обнаружены программным обеспечением как одно пятно, а части пятна могут быть исключены из количественного определения), а также различия в алгоритмах программного обеспечения и, следовательно, в тенденциях анализа.
Сгенерированные списки комплектации можно экспортировать из некоторых пакетов программного обеспечения. [9] и используется для автоматического расщепления белковых пятен в геле и последующей идентификации белков с помощью масс-спектрометрии . Масс-спектрометрический анализ может выявить точные измерения массы наряду с секвенированием пептидов, которые находятся в диапазоне 1000–4000 атомных единиц массы. [10] Обзор современного подхода к программному анализу изображений геля 2DE см. в Berth et al. [11] или Бандоу и др. [12]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ О'Фаррелл, PH (1975). «Двумерный электрофорез белков высокого разрешения» . Ж. Биол. Хим . 250 (10): 4007–21. дои : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . ПМЦ 2874754 . ПМИД 236308 .
- ^ Клозе, Дж (1975). «Картирование белков с помощью комбинированного изоэлектрического фокусирования и электрофореза тканей мыши. Новый подход к тестированию индуцированных точковых мутаций у млекопитающих» . Гумангенетика . 26 (3): 231–43. дои : 10.1007/bf00281458 . ПМИД 1093965 . S2CID 30981877 .
- ^ Свитцер RC 3-й, Меррил CR, Шифрин С (1979). «Высокочувствительная окраска серебром для обнаружения белков и пептидов в полиакриламидных гелях». Аналитическая биохимия . 98 (1): 231–37. дои : 10.1016/0003-2697(79)90732-2 . ПМИД 94518 .
- ^ Миккельсен, Сьюзен; Кортон, Эдуардо (2004). Биоаналитическая химия . Джон Уайли и сыновья, Inc. п. 224 . ISBN 978-0-471-62386-1 .
- ^ Арора П.С., Ямагива Х., Шривастава А., Боландер М.Е., Саркар Г. (2005). «Сравнительная оценка двух программных приложений для анализа изображений двумерного гель-электрофореза с использованием синовиальной жидкости пациентов с заболеваниями суставов». Дж. Ортоп Ски . 10 (2): 160–66. дои : 10.1007/s00776-004-0878-0 . ПМИД 15815863 . S2CID 45193214 .
- ^ Кан, Юньи; Теханукул, Танасит; Манталарис, Анфанасиос; Надь, Юдит М. (февраль 2009 г.). «Сравнение трех коммерчески доступных пакетов программного обеспечения для анализа DIGE: минимальное вмешательство пользователя в протеомику на основе геля» . Журнал исследований протеома . 8 (2): 1077–1084. дои : 10.1021/pr800588f . ISSN 1535-3893 . ПМИД 19133722 .
- ^ Педрески Р., Хертог М.Л., Карпентье С.С. и др. (апрель 2008 г.). «Обработка пропущенных значений для многомерного статистического анализа данных протеомики на основе геля». Протеомика . 8 (7): 1371–83. дои : 10.1002/pmic.200700975 . hdl : 1942/8262 . ПМИД 18383008 . S2CID 21152053 .
- ^ Что такое пропущенные значения и почему они представляют собой проблему?
- ^ «Программное обеспечение для протеомного анализа двумерного гель-электрофореза | SameSpots» . ТоталЛаб . Проверено 8 июля 2024 г.
- ^ Лепедда, Антонио Дж. и Марилена Формато. «Применение технологии двумерного электрофореза для изучения атеросклероза». EJIFCC том. 19,3 146–159. 20 декабря 2008 г.
- ^ Берт М., Мозер Ф.М., Кольбе М., Бернхардт Дж. (октябрь 2007 г.). «Современное состояние анализа двумерных изображений гель-электрофореза» . Прил. Микробиол. Биотехнология . 76 (6): 1223–43. дои : 10.1007/s00253-007-1128-0 . ПМК 2279157 . ПМИД 17713763 .
- ^ Бандоу Дж.Э., Бейкер Дж.Д., Берт М. и др. (август 2008 г.). «Улучшенный рабочий процесс анализа изображений для двумерных гелей позволяет проводить крупномасштабные двухмерные протеомные исследования на основе гелей - исследование по обнаружению биомаркеров ХОБЛ». Протеомика . 8 (15): 3030–41. дои : 10.1002/pmic.200701184 . ПМИД 18618493 . S2CID 206361897 .
Внешние ссылки
[ редактировать ]- Программное обеспечение SameSpots для двумерного протеомного анализа.
- JVirGel Создавайте виртуальные двухмерные гели на основе данных последовательности.
- Gel IQ Бесплатно загружаемый программный инструмент для оценки качества данных анализа 2D-изображений геля.
- Справочник по принципам и методам двумерного электрофореза
