Аффинный электрофорез
Аффинный электрофорез — общее название многих аналитических методов, используемых в биохимии и биотехнологии . Как качественную, так и количественную информацию можно получить с помощью аффинного электрофореза. [1] Перекрестный электрофорез, первый метод аффинного электрофореза, был создан Накамурой и др. Фермент-субстратные комплексы были обнаружены с помощью перекрестного электрофореза. [2] [3] [4] [5] [6] Эти методы включают так называемый анализ электрофоретического сдвига подвижности , электрофорез со сдвигом заряда и аффинный капиллярный электрофорез . [1] Методы основаны на изменении электрофоретической картины молекул (главным образом макромолекул ) за счет биоспецифического взаимодействия или комплексообразования . Взаимодействие или связывание молекулы, заряженной или незаряженной, обычно меняет электрофоретические свойства молекулы. [7] [1] Мембранные белки можно идентифицировать по сдвигу подвижности, вызванному заряженным детергентом . Нуклеиновые кислоты или фрагменты нуклеиновых кислот могут характеризоваться их сродством к другим молекулам. Эти методы использовались для оценки констант связывания , например, при аффинном электрофорезе лектинов или характеристике молекул с особыми характеристиками, такими как содержание гликанов или связывание лигандов . [1] одномерный электрофорез, аналогичный встречному электрофорезу или «ракетному иммуноэлектрофорезу» , аффинный электрофорез. Для ферментов и других лиганд-связывающих белков в качестве альтернативного количественного определения белка можно использовать [8] Некоторые из методов аналогичны аффинной хроматографии за счет использования иммобилизованных лигандов .
Виды и методы
[ редактировать ]В настоящее время продолжаются исследования по разработке новых способов использования знаний, уже связанных с аффинным электрофорезом, для улучшения его функциональности и скорости, а также предпринимаются попытки улучшить уже существующие методы и адаптировать их для решения конкретных задач.
Электрофорез в агарозном геле
[ редактировать ]
Тип анализа изменения электрофоретической подвижности (AMSA), электрофорез в агарозном геле используется для отделения комплексов связанных с белком аминокислот от свободных аминокислот. Используя низкое напряжение (~ 10 В/см), чтобы минимизировать риск теплового повреждения, через агарозный гель пропускают электричество. При растворении в горячем буферном растворе (от 50 до 55 градусов Цельсия) он образует вязкий раствор, но при охлаждении затвердевает в виде геля. С помощью этого метода разделяют сывороточные белки, гемоглобин, нуклеиновые кислоты, продукты полимеразной цепной реакции и т. д. Фиксированные сульфатные группы агарозы могут вызывать усиление электроэндосмоса, что снижает разрешение полосы. Использование сверхчистого агарозного геля с небольшим содержанием сульфатов может остановить это. [ нужна ссылка ]
Быстрый электрофорез в агарозном геле
[ редактировать ]В этом методе используется высокое напряжение ( ≥ 20 В/см ) с 0,5-кратным трис-боратным буфером, проходящим через агарозный гель. [9] Этот метод отличается от традиционного электрофореза в агарозном геле тем, что в нем используется более высокое напряжение, что позволяет сократить время анализа, а также обеспечить более высокое разрешение полосы. Другими факторами, включенными в разработку метода быстрого электрофореза в агарозном геле, являются толщина геля и процентное содержание агарозы в геле.
Борнатный аффинный электрофорез
[ редактировать ]используются акриламидные В боронатном аффинном электрофорезе для очистки НАД-РНК гели, наполненные бороновой кислотой. Эта очистка позволяет исследователям легко измерить кинетическую активность ферментов, декапирующих НАД-РНК. [10]
Аффинный капиллярный электрофорез
[ редактировать ]Аффинный капиллярный электрофорез (АПФ) относится к ряду методов, которые основаны на специфических и неспецифических связывающих взаимодействиях для облегчения разделения и обнаружения с помощью формулярного подхода в соответствии с теорией электромиграции . [11] [12] Используя межмолекулярные взаимодействия между молекулами, происходящими в свободном растворе или мобилизованными на твердой подложке, ACE позволяет разделять и количественно определять концентрации аналитов, а также константы связывания и диссоциации между молекулами. [13] [14] В качестве аффинных зондов при CAE используются меченные флуорофором соединения, обладающие сродством к целевым молекулам. [15] С помощью ACE ученые надеются разработать кандидаты на лекарства с сильным связыванием, понять и измерить ферментативную активность, а также охарактеризовать заряды белков. [16] Аффинный капиллярный электрофорез можно разделить на три различных метода: неравновесный электрофорез уравновешенных смесей образцов, ACE с динамическим равновесием и ACE на основе аффинности. [13]
Неравновесный электрофорез равновесных смесей образцов обычно используется при разделении и изучении связывающих взаимодействий крупных белков и включает объединение аналита и его молекулы-рецептора в предварительно смешанный образец.
Эти молекулы рецептора часто принимают форму аффинных зондов, состоящих из молекул, меченных флуорофором, которые будут связываться с целевыми молекулами, смешанными с тестируемым образцом. [13] Эту смесь и ее последующие комплексы затем разделяют посредством капиллярного электрофореза. [13] Поскольку исходная смесь молекул аналита и рецептора была связана вместе в равновесии, медленная диссоциация этих двух связанных молекул во время электрофоретического эксперимента приведет к их разделению и последующему сдвигу равновесия в сторону дальнейшей диссоциации. [17] Характерная картина размазывания, возникающая в результате медленного высвобождения аналита из комплекса во время эксперимента, может быть использована для расчета константы диссоциации комплекса. [17]
Динамическое равновесие ACE предполагает сочетание аналита, обнаруженного в образце, и его рецепторной молекулы, обнаруженной в буферном растворе в капиллярной трубке, так что связывание и разделение происходят только в приборе. [13] При динамическом равновесном аффинном капиллярном электрофорезе предполагается, что связывание лиганд-рецептор происходит быстро при смешивании аналита и буфера. Константы связывания обычно получают с помощью этого метода на основе сдвига пика миграции рецептора, который зависит от концентрации аналита в образце. [13]
Капиллярный электрофорез на основе аффинности, также известный как капиллярная электроаффинная хроматография (CEC), включает связывание аналита в образце с иммобилизованной молекулой рецептора на стенке капилляра, микрогранулах или микроканалах. [18] CEC обеспечивает самую высокую эффективность разделения среди всех трех методов ACE, поскольку нематричные компоненты образца вымываются, а затем лиганд высвобождается и анализируется. [13]
Аффинный капиллярный электрофорез использует преимущества капиллярного электрофореза и применяет их для изучения белковых взаимодействий. [16] Преимущество ACE заключается в том, что он имеет высокую эффективность разделения, имеет более короткое время анализа, может проводиться при физиологическом pH и предполагает низкое потребление лиганда/молекул. [19] [20] Кроме того, для проведения исследований АПФ не обязательно знать состав интересующего белка. [16] Однако основным недостатком является то, что он не дает много стехиометрической информации об изучаемой реакции. [20]
Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой
[ редактировать ]Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой (ПААГ) стал одним из самых популярных методов разделения белков. Это связано не только с его разделительными качествами, но и с тем, что его можно использовать в сочетании с множеством других аналитических методов, таких как масс-спектрометрия и вестерн-блоттинг. [14] Ожидается, что помимо выделения и очистки белков из биологических образцов AT-PAGE будет полезен при анализе вариаций экспрессии конкретных белков, а также в исследованиях посттрансляционных модификаций белков. [21] Этот метод использует двухэтапный подход. Сначала образец белка пропускают через полиакриламидный гель с помощью электрофореза. Затем образец переносится в другой полиакриламидный гель (гель с аффинной ловушкой), где иммобилизуются аффинные зонды. Белки, не обладающие сродством к аффинным зондам, проходят через гель с аффинной ловушкой, а белки, обладающие сродством к зондам, будут «захвачены» неподвижными аффинными зондами. Эти захваченные белки затем визуализируются и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии после расщепления в геле. [14]
Фосфатаффинный электрофорез
[ редактировать ]Для аффинного электрофореза фосфата используется аффинный зонд, который состоит из молекулы, которая специфически связывается с ионами двухвалентного фосфата в нейтральном водном растворе, известного как «Phos-Tag». В этом методе также используется разделительный гель, изготовленный из сополимеризованного мономера Phos-Tag с подвеской по акриламиду. Фосфорилированные белки медленно мигрируют в геле по сравнению с нефосфорилированными белками. Этот метод дает исследователю возможность наблюдать различия в состояниях фосфорилирования любого белка. [14] Этот метод позволяет обнаруживать отдельные полосы даже в белковых молекулах, которые имеют одинаковое количество фосфорилированных аминокислотных остатков, но фосфорилированы в разных местах аминокислот. [22] [23]
См. также
[ редактировать ]Ссылки
[ редактировать ]- ^ Jump up to: а б с д Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Койке, Тору (18 марта 2015 г.). «Передовые технологии аффинного электрофореза» . Протеомы . 3 (1): 42–55. doi : 10.3390/протеомы3010042 . ISSN 2227-7382 . ПМК 5302491 . ПМИД 28248262 .
- ^ Накамура, С.; Такео, К.; Сасаки, И.; Мурата, М. (август 1959 г.). «Доказательство образования фермент-субстратного комплекса методом перекрестного бумажного электрофореза » . Природа . 184 (4686): 638–639. Бибкод : 1959Natur.184..638N . дои : 10.1038/184638a0 . ISSN 0028-0836 . PMID 14425900 . S2CID 4215250 .
- ^ Накамура, С.; Такео, К.; Сасаки, И. (январь 1962 г.). «Обнаружение фермент-субстратных комплексов методом перекрестного электрофореза» . Журнал физиологической химии Хоппе-Зейлера . 328 (годовой том): 139–144. дои : 10.1515/bchm2.1962.328.1.139 . ISSN 0018-4888 . ПМИД 14478156 .
- ^ Накамура, Сёдзиро; Такео, Казусукэ; Сасаки, Иване (январь 1963 г.). «Обнаружение фермент-субстратных комплексов в неактивных или инактивированных ферментах» . Журнал физиологической химии Хоппе-Зейлера . 334 (годовой том): 95–102. дои : 10.1515/bchm2.1963.334.1.95 . ISSN 0018-4888 . ПМИД 14136727 .
- ^ Такео, Казусукэ; Накамура, Сёдзиро (ноябрь 1972 г.). «Константы диссоциации глюканфосфорилаз тканей кролика, изученные методом дискового электрофореза в полиакриламидном геле» . Архив биохимии и биофизики . 153 (1): 1–7. дои : 10.1016/0003-9861(72)90413-4 . ПМИД 4119570 .
- ^ Такео, Казусукэ; Нитта, Казуко; Накамура, Сёдзиро (ноябрь 1974 г.). «Демонстрация фосфорилазы в моче с помощью дискового электрофореза в полиакриламидном геле» . Клиника Химика Акта . 57 (1): 45–54. дои : 10.1016/0009-8981(74)90176-4 . ПМИД 4430142 .
- ^ Айзпуруа-Олайсола, Ойер; Састре Торано, Хавьер; Пукин, Алексей; Фу, Оу; Бунс, Герт Ян; де Йонг, Герхардус Дж.; Питерс, Роланд Дж. (январь 2018 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для оценки аффинности связывания ингибиторов холерного токсина на основе углеводов». Электрофорез . 39 (2): 344–347. дои : 10.1002/elps.201700207 . hdl : 1874/362143 . ПМИД 28905402 . S2CID 33657660 .
- ^ Диб, Сами Эл; Ветциг, Герман; Эль-Хади, Дейя Абд (июль 2013 г.). «Капиллярный электрофорез для исследования биофармацевтических препаратов и их фармацевтически значимых связывающих свойств». TrAC Тенденции в аналитической химии . 48 : 112–131. дои : 10.1016/j.trac.2013.04.005 .
- ^ Реам Дж.А., Льюис Л.К., Льюис К.А. (октябрь 2016 г.). «Быстрый анализ электрофоретического сдвига подвижности в агарозном геле для количественного определения взаимодействия белка: РНК» . Аналитическая биохимия . 511 : 36–41. дои : 10.1016/j.ab.2016.07.027 . ПМК 5002362 . ПМИД 27495142 .
- ^ «Боронатный аффинный электрофорез для очистки и анализа РНК, модифицированной кофактором». Институт фармации и молекулярной биотехнологии, Гейдельбергский университет, 69120 Гейдельберг, Германия .
- ^ Дубский П., Дворжак М., Ансорж М. (2016). «Аффинный капиллярный электрофорез: теория электромиграции». Аналитическая и биоаналитическая химия . 408 (30): 8623–8641. дои : 10.1007/s00216-016-9799-y . ПМИД 27558099 . S2CID 31146155 .
- ^ Штутц, Ханно (январь 2023 г.). «Достижения и применение методов капиллярной электромиграции в анализе терапевтических и диагностических рекомбинантных белков – обзор» . Журнал фармацевтического и биомедицинского анализа . 222 : 115089. doi : 10.1016/j.jpba.2022.115089 . ПМИД 36279846 . S2CID 252675814 .
- ^ Jump up to: а б с д и ж г Хегор, Нильс Х.Х; Нильссон, Стаффан; Гусман, Норберто А. (11 сентября 1998 г.). «Аффиный капиллярный электрофорез: важные области применения и некоторые последние разработки». Журнал хроматографии B: Биомедицинские науки и приложения . 715 (1): 29–54. дои : 10.1016/S0378-4347(98)00258-8 . ISSN 0378-4347 . ПМИД 9792496 .
- ^ Jump up to: а б с д Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Койке, Тору (18 марта 2015 г.). «Передовые технологии аффинного электрофореза» . Протеомы . 3 (1): 42–55. doi : 10.3390/протеомы3010042 . ПМК 5302491 . ПМИД 28248262 .
- ^ Симура, Киёхито.; Каргер, Барри Л. (1 января 1994 г.). «Капиллярный электрофорез с аффинным зондом: анализ рекомбинантного гормона роста человека с флуоресцентно-меченым фрагментом антитела» . Аналитическая химия . 66 (1): 9–15. дои : 10.1021/ac00073a004 . ISSN 0003-2700 . ПМИД 8116876 .
- ^ Jump up to: а б с Чу, Йен-Хо; Авила, Луис З.; Гао, Цзиньмин; Уайтсайдс, Джордж М. (ноябрь 1995 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез». Отчеты о химических исследованиях . 28 (11): 461–468. дои : 10.1021/ar00059a004 . ISSN 0001-4842 .
- ^ Jump up to: а б Крылов, Сергей Н. (2006). «Неравновесный капиллярный электрофорез равновесных смесей (NECEEM): новый метод биомолекулярного скрининга» . Журнал биомолекулярного скрининга . 11 (2): 115–122. дои : 10.1177/1087057105284339 . ISSN 1087-0571 . ПМИД 16418314 .
- ^ Дингес, Мередит М.; Солакилдирим, Кемаль; Ларив, Синтия К. (май 2014 г.). «Аффинный капиллярный электрофорез для определения аффинности связывания низкомолекулярных гепаринов и антитромбина-III: CE и CEC». Электрофорез . 35 (10): 1469–1477. дои : 10.1002/elps.201300549 . ПМИД 24616065 . S2CID 20484201 .
- ^ Ю, Фанчжи; Чжао, Цян; Чжан, Дапэн; Юань, Чжэн; Ван, Хайлинь (2 января 2019 г.). «Аффинные взаимодействия посредством капиллярного электрофореза: связывание, разделение и обнаружение». Аналитическая химия . 91 (1): 372–387. дои : 10.1021/acs.analchem.8b04741 . ISSN 0003-2700 . ПМИД 30392351 . S2CID 53217680 .
- ^ Jump up to: а б «Аффиный капиллярный электрофорез | Учебный центр MyBioSource» . Учебный центр Mybiosource . Проверено 13 декабря 2019 г.
- ^ Авада, Тихиро; Сато, Такаши; Такао, Тосифуми (15 января 2010 г.). «Электрофорез в полиакриламидном геле с аффинной ловушкой: новый метод захвата специфических белков путем электропереноса» . Аналитическая химия . 82 (2): 755–761. дои : 10.1021/ac902290q . ISSN 0003-2700 . ПМИД 20038085 .
- ^ Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Мацубара, Мамору; Аоки, Юрий; Охи, Шиори; Мури, Юка; Койке, Тору (февраль 2009 г.). «Двумерный фосфат-аффинный гель-электрофорез для анализа изотипов фосфопротеинов» . Электрофорез . 30 (3): 550–559. дои : 10.1002/elps.200800386 . ПМИД 19156764 . S2CID 39358740 .
- ^ Киносита, Эйдзи; Киносита-Кикута, Эмико; Мацубара, Мамору; Ямада, Сейджи; Накамура, Хиро; Сиро, Ёсицугу; Аоки, Юрий; Окита, Коуки; Койке, Тору (август 2008 г.). «Разделение изотипов фосфопротеинов, имеющих одинаковое количество фосфатных групп, с помощью фосфат-аффинного SDS-PAGE» . Протеомика . 8 (15): 2994–3003. дои : 10.1002/pmic.200800243 . ПМИД 18615432 . S2CID 32263510 .
