Электрофоретический анализ изменения подвижности
Электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA) или электрофорез сдвига подвижности , также называемый анализом сдвига в геле , анализом сдвига подвижности в геле , анализом сдвига полосы или анализом замедления в геле , является распространенным методом аффинного электрофореза, используемым для изучения белка-ДНК или белка . Взаимодействия РНК . Эта процедура может определить, способен ли белок или смесь белков связываться с данной последовательностью ДНК или РНК, а иногда может указать, участвует ли в связывающем комплексе более одной белковой молекулы. Анализы сдвига геля часто проводятся in vitro одновременно с экспериментами по ДНКазному отслеживанию , удлинению праймеров и экспериментам с промотором-зондом при изучении инициации транскрипции , репликации групп ДНК, репарации ДНК или процессинга и созревания РНК, а также сплайсинга пре-мРНК. [1] Хотя предшественники можно найти в более ранней литературе, большинство современных анализов основаны на методах, описанных Гарнером и Ревзином. [2] и Фрид и Кротерс . [3]
Принцип
[ редактировать ]Анализ изменения подвижности представляет собой электрофоретическое разделение смеси белок-ДНК или белок-РНК на полиакриламидном или агарозном геле в течение короткого периода времени (около 1,5-2 часов для геля размером 15-20 см). [4] Скорость, с которой различные молекулы (и их комбинации) движутся через гель, определяется их размером и зарядом и, в меньшей степени, их формой (см. гель-электрофорез ). Контрольная дорожка (зонд ДНК без присутствия белка) будет содержать одну полосу, соответствующую несвязанному фрагменту ДНК или РНК. Однако, если предположить, что белок способен связываться с фрагментом, дорожка с присутствующим белком, который связывается, будет содержать другую полосу, которая представляет собой более крупный и менее мобильный комплекс зонда нуклеиновой кислоты, связанного с белком, который «сдвинут» вверх на геле. (поскольку он двигался медленнее).
При правильных экспериментальных условиях взаимодействие между ДНК (или РНК) и белком стабилизируется, а соотношение связанной и несвязанной нуклеиновой кислоты в геле отражает долю свободных и связанных молекул зонда, когда реакция связывания поступает в гель. Эта стабильность частично обусловлена «эффектом клетки», когда белок, окруженный гелевой матрицей, не может диффундировать от зонда до того, как они рекомбинируются. [5] Если известны начальные концентрации белка и зонда и если известна стехиометрия комплекса, можно определить кажущееся сродство белка к последовательности нуклеиновой кислоты. [6] Если комплекс не является очень долгоживущим в условиях геля или не принимается во внимание диссоциация во время электрофореза, полученное число представляет собой кажущийся Kd. Если концентрация белка неизвестна, но известна стехиометрия комплекса, концентрацию белка можно определить путем увеличения концентрации зонда ДНК до тех пор, пока дальнейшее увеличение не приведет к увеличению доли связанного белка. Сравнивая набор стандартных разведений свободного зонда с тем же гелем, можно рассчитать количество молей белка. [4]
Варианты и дополнения
[ редактировать ]К этой смеси можно добавить антитело, распознающее белок, чтобы создать еще более крупный комплекс с большим сдвигом. Этот метод называется анализом суперсдвига и используется для однозначной идентификации белка, присутствующего в комплексе белок-нуклеиновая кислота.
Часто дополнительную дорожку используют с конкурирующим олигонуклеотидом, чтобы определить наиболее благоприятную последовательность связывания для связывающего белка. Использование различных олигонуклеотидов с определенной последовательностью позволяет идентифицировать точный сайт связывания путем конкуренции (не показано на диаграмме). Варианты конкурентного анализа полезны для измерения специфичности связывания и измерения кинетики ассоциации и диссоциации. Таким образом, EMSA также может использоваться как часть эксперимента SELEX для отбора олигонуклеотидов, которые действительно связывают данный белок. [ нужна ссылка ]
Как только связывание ДНК с белком будет определено in vitro , ряд алгоритмов может сузить поиск по идентификации транскрипционного фактора. Олигонуклеотиды консенсусной последовательности интересующего транскрипционного фактора смогут конкурировать за связывание, устраняя сдвинутую полосу, и должны быть подтверждены суперсдвигом. Если предсказанная консенсусная последовательность не может конкурировать за связывание, идентификации транскрипционного фактора может способствовать метод Multiplexed Competitor EMSA (MC-EMSA), при котором большие наборы консенсусных последовательностей мультиплексируются в каждой реакции, и когда один набор конкурирует за связывание, отдельные консенсусные последовательности из этого набора используются в дальнейшей реакции. [7]
Для целей визуализации фрагмент нуклеиновой кислоты обычно метят радиоактивной , флуоресцентной или биотиновой меткой. Стандартное окрашивание бромистым этидием менее чувствительно, чем эти методы, и может не обладать чувствительностью для обнаружения нуклеиновой кислоты, если в этих экспериментах используются небольшие количества нуклеиновой кислоты или одноцепочечной нуклеиновой кислоты. При использовании биотиновой метки для обнаружения фрагмента ДНК используется стрептавидин , конъюгированный с таким ферментом, как пероксидаза хрена. [8] [9] Хотя мечение изотопной ДНК практически не влияет на аффинность связывания белка, использование неизотопных меток, включая флурофоры или биотин, может изменить аффинность и/или стехиометрию интересующего белкового взаимодействия. Конкуренция между зондом, меченным флуорофором или биотином, и немеченой ДНК той же последовательности может быть использована для определения того, изменяет ли метка аффинность связывания или стехиометрию.
Ссылки
[ редактировать ]- ^ Гранадино Б., Пенальва Л.О., Грин М.Р., Валькарсель Дж., Санчес Л. 1997. Proc NatlAcad Sci USA 94: 7343-8.
- ^ Гарнер М.М., Ревзин А. (июль 1981 г.). «Метод гель-электрофореза для количественной оценки связывания белков со специфическими участками ДНК: применение к компонентам регуляторной системы лактозного оперона Escherichia coli» . Нуклеиновые кислоты Рез . 9 (13): 3047–60. дои : 10.1093/нар/9.13.3047 . ПМК 327330 . ПМИД 6269071 .
- ^ Фрид М., Кротерс Д.М. (декабрь 1981 г.). «Равновесия и кинетика lac-репрессорно-операторных взаимодействий при электрофорезе в полиакриламидном геле» . Нуклеиновые кислоты Рез . 9 (23): 6505–25. дои : 10.1093/нар/9.23.6505 . ПМК 327619 . ПМИД 6275366 .
- ^ Jump up to: а б Осубель, Фредерик М. (1994). Современные протоколы в молекулярной биологии . Чичестер: Джон Уайли и сыновья. стр. 12.2.1–11. ISBN 0-471-50337-1 .
- ^ Фрид М.Г., Лю Г. (1994). «Молекулярная секвестрация стабилизирует комплексы CAP-ДНК во время электрофореза в полиакриламидном геле» . Исследования нуклеиновых кислот . 22 (23): 5054–5059. дои : 10.1093/нар/22.23.5054 . ПМК 523777 . ПМИД 7800499 .
- ^ Фрид М.Г. (1989). «Измерение параметров взаимодействия белок-ДНК методом электрофореза сдвига подвижности». Электрофорез . 10 (5–6): 366–376. дои : 10.1002/elps.1150100515 . ПМИД 2670548 . S2CID 19372331 .
- ^ Смит А.Дж., Хамфрис С.Э. (январь 2009 г.). «Характеристика ДНК-связывающих белков с использованием мультиплексированного конкурента EMSA». Дж. Мол. Биол . 385 (3): 714–7. дои : 10.1016/j.jmb.2008.11.035 . ПМИД 19059416 .
- ^ Хеллман, Лэнс М; Фрид, Майкл Дж. (2007). «Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) для обнаружения взаимодействий белок-нуклеиновая кислота» . Протоколы природы . 2 (8): 1849–1861. дои : 10.1038/nprot.2007.249 . ISSN 1754-2189 . ПМЦ 2757439 . ПМИД 17703195 .
- ^ Осмосенсорство и осмосигнализация . Академическая пресса. 1 октября 2007 г., стр. 288–. ISBN 978-0-08-055211-8 .
